Nové molekulární přístupy pro diagnostiku infekcí protetických kloubů

Subjekty Do studie bude zařazeno celkem 70 pacientů z Kliniky rekonstrukční chirurgie a osteoartikulárních infekcí (CRIO) a kyčelních jednotek IRCCS Ospedale Galeazzi -Sant'Ambrogio pro podezření na infekci jejich protézy. Každý vzorek bude analyzován jak tradiční kulturou, tak sekvenováním nové generace (NGS).

Na základě kultivačních výsledků budou pacienti rozděleni do 3 skupin.

Odběr vzorků pro molekulární analýzu Vzorky z periprotetické tkáně s makroskopickými známkami infekce budou odebrány ze synoviální membrány, rozhraní kost-protetika a intramedulárních kanálků. Synoviální tekutina bude před provedením artrotomie sterilně odebírána do nádobek bez DNAázy a RNázy pro analýzu NGS. K odběru vzorků z rozhraní mezi tkání a kostním implantátem az intramedulárního kanálu pro analýzu NGS budou použity sterilní tampony a polštářky. Kostní tkáň bude odebrána pomocí nového sterilního instrumentária. Vzorky budou zmrazeny do 2 hodin od odběru při -80°C do .

Odběr vzorku pro kultivaci Odběr vzorků periprotetických tkání a implantátu bude proveden během operace po řádné expozici postiženého místa. Synoviální tekutina bude shromažďována ve sterilních zkumavkách se šroubovacím uzávěrem. Periprotetické tkáně a implantát budou odebírány do sterilních nádob za použití nového sterilního instrumentária. Všechny vzorky budou odeslány do laboratoře do 2 hodin od odběru. Vzorky po ošetření 0,1 % (w:v) dithiothreitolem k odstranění bakterií z biofilmu budou kultivovány na agarových plotnách a bujónu pro aerobní a anaeroby po dobu 15 dnů. Mikrobiální identifikace bude provedena biochemickými testy.

Další vzorek tkáně odebraný do samostatné sterilní zkumavky se šroubovacím uzávěrem bude použit pro odstranění hostitelské DNA k izolaci mikrobiální DNA pro brokovnici NGS. Vzorky budou ošetřeny saponinem a/nebo různými komerčními soupravami pro extrakci mikrobiální DNA. dsDNA bude kvantifikována Qubitovým fluorometrem a její čistota bude stanovena nanokapkovým spektofotometrem.

Analýza synoviální tekutiny Synoviální tekutina pro stanovení počtu leukocytů a diferenciálu bude odebírána do zkumavek obsahujících EthylenDiaminoTetraAcetic Acid (EDTA) a analyzována pomocí hematologického analyzátoru Sysmex XN.

Stanovení synoviálního proteinu, glukózy, C-reaktivního proteinu (CRP) a leukocytární esterázy bude provedeno na synoviální tekutině odebrané do zkumavek obsahujících aktivátor sraženiny. Měření proteinů, glukózy a CRP bude provedeno na analyzátoru Atellica CH a IM (Siemens), přičemž leukocytární esteráza byla stanovena pomocí proužků pro analýzu moči.

Molekulární analýza 70 vzorků bude zasláno do specializované laboratoře, která provede extrakci nukleových kyselin z typů biologických vzorků pomocí speciálních technik, které zahrnují koncentraci buněčného materiálu, mechanickou lýzu a odstranění organických inhibitorů a lidské hostitelské DNA. Každý vzorek bude zpracován s pozitivní a negativní kontrolou extrakce, aby byla zajištěna kvalita.

Na konci studie bude veškerý zbytkový biologický materiál zničen

Statistická metodika Velikost vzorku Velikost vzorku byla vypočítána s ohledem jako primární výsledek na shodu inovativní molekulární metody a tradiční kultivace periprostetické tkáně a synoviální tekutiny při definování pacientů jako pozitivních nebo negativních na infekce protetických kloubů. Na základě zkušeností vyšetřovatelů je podíl pacientů podstupujících revizní operaci pro selhání kolenního a kyčelního implantátu v IRCCS Ospedale Galeazzi Sant'Ambrogio s diagnózou infekce protetického kloubu na základě kulturního vyšetření 45 %. Pokud vezmeme v úvahu odchylku 15 %, alfa = 0,05 a sílu = 80 %, je počet testovaných pacientů 70.

Metodika analýzy Kategorická data budou popsána jako absolutní a relativní četnosti, zatímco spojitá data budou popsána jako průměr a 95% interval spolehlivosti, pokud jsou normálně rozděleny, nebo jako medián a interkvartilní rozmezí, v případě nenormálního rozdělení. Normální distribuce bude hodnocena Shapiro-Wilkovým testem.

Rozdíly v proporcích budou hodnoceny Fisherovým exaktním testem nebo Chí-kvadrát testem; kontinuální porovnávání proměnných mezi třemi skupinami bude provedeno pomocí testu One-Way Analysis Of Variance (ANOVA) pro normálně rozdělená data nebo pomocí Kruskal-Wallisova testu, v případě nenormálního rozdělení.

Shoda molekulárních metod s tradiční kultivací periprostetické tkáně a synoviální tekutiny bude testována pomocí Choenovy kappa.

Bude také hodnocena citlivost a specificita každého testu.