Neue molekulare Ansätze zur Diagnose von Gelenkprotheseninfektionen

Probanden: Insgesamt 70 Patienten aus der Abteilung für Rekonstruktive Chirurgie und osteoartikuläre Infektionen (CRIO) und den Hüftabteilungen des IRCCS Ospedale Galeazzi-Sant'Ambrogio wegen Verdachts auf eine Infektion ihrer Prothese werden in die Studie aufgenommen. Jede Probe wird sowohl mit traditioneller Kultur als auch mit Next Generation Sequencing (NGS) analysiert.

Auf der Grundlage der Kulturergebnisse werden die Patienten in drei Gruppen eingeteilt.

Probenentnahme für die molekulare Analyse. Proben aus periprothetischem Gewebe mit makroskopischen Anzeichen einer Infektion werden aus der Synovialmembran, der Knochen-Prothesen-Schnittstelle und den intramedullären Kanälen entnommen. Synovialflüssigkeit wird zur NGS-Analyse steril in DNAse- und RNAse-freien Behältern gesammelt, bevor die Arthrotomie durchgeführt wird. Mit sterilen Tupfern und Pads werden Proben aus der Grenzfläche zwischen Gewebe und Knochenimplantat sowie aus dem intramedullären Kanal für die NGS-Analyse entnommen. Knochengewebe wird mit neuen sterilen Instrumenten gesammelt. Die Proben werden innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme bei -80 °C bis eingefroren.

Probenentnahme für die Kultur. Die Probenentnahme von periprothetischen Geweben und Implantaten wird während der Operation nach ordnungsgemäßer Freilegung der betroffenen Stelle durchgeführt. Die Synovialflüssigkeit wird in sterilen Röhrchen mit Schraubverschluss gesammelt. Periprothetische Gewebe und Implantate werden mithilfe neuer steriler Instrumente in sterilen Behältern gesammelt. Alle Proben werden innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme an das Labor geschickt. Proben nach der Behandlung mit 0,1 % (w:v) Dithiothreitol zur Entfernung von Bakterien aus dem Biofilm werden 15 Tage lang auf Agarplatten und Brühe für Aerobier und Anaerobier kultiviert. Die mikrobielle Identifizierung erfolgt durch biochemische Tests.

Eine weitere Gewebeprobe, die in einem separaten sterilen Röhrchen mit Schraubverschluss gesammelt wird, wird zur Entfernung der Wirts-DNA zur Isolierung mikrobieller DNA für Shotgun-NGS verwendet. Die Proben werden mit Saponin und/oder verschiedenen kommerziellen Kits zur mikrobiellen DNA-Extraktion behandelt. Die dsDNA wird mit einem Qubit-Fluorometer quantifiziert und ihre Reinheit wird mit einem Nanotropfen-Spektrophotometer bestimmt.

Synovialflüssigkeitsanalyse Synovialflüssigkeit zur Leukozytenzahl und Differenzierung wird in Röhrchen mit Ethylen-Diaminotetraessigsäure (EDTA) gesammelt und mit einem hämatologischen Sysmex XN-Analysegerät analysiert.

Die Bestimmung von Synovialprotein, Glukose, C-reaktivem Protein (CRP) und Leukozytenesterase erfolgt an Synovialflüssigkeit, die in Röhrchen mit Gerinnungsaktivator gesammelt wurde. Die Messung von Proteinen, Glukose und CRP wird mit dem Atellica CH- und IM-Analysegerät (Siemens) durchgeführt, während die Leukozytenesterase mithilfe von Streifen zur Urinanalyse bestimmt wurde.

Molekulare Analyse 70 Proben werden an ein Speziallabor geschickt, das die Nukleinsäureextraktion aus biologischen Probentypen unter Verwendung maßgeschneiderter proprietärer Techniken durchführt, die die Konzentration von Zellmaterial, mechanische Lyse und die Entfernung organischer Inhibitoren und menschlicher Wirts-DNA umfassen. Jede Probe wird mit einer positiven und negativen Extraktionskontrolle verarbeitet, um die Qualität sicherzustellen.

Am Ende der Studie wird das restliche biologische Material vernichtet

Statistische Methodik Stichprobengröße Die Stichprobengröße wurde unter Berücksichtigung der Übereinstimmung der innovativen molekularen Methode und der traditionellen Kultur von periprothetischem Gewebe und Synovialflüssigkeit als primäres Ergebnis berechnet bei der Definition eines Patienten als positiv oder negativ für prothetische Gelenkinfektionen. Basierend auf den Erfahrungen der Untersucher beträgt der Anteil der Patienten, die sich im IRCCS Ospedale Galeazzi Sant'Ambrogio einer Revisionsoperation wegen Knie- und Hüftimplantatversagens unterziehen und bei denen aufgrund einer kulturellen Untersuchung eine Gelenkprotheseninfektion diagnostiziert wurde, 45 %. Unter Berücksichtigung einer Fehlerquote von 15 %, einem Alpha = 0,05 und einer Trennschärfe von 80 % beträgt die Anzahl der zu testenden Patienten 70.

Analysemethodik Kategorische Daten werden als absolute und relative Häufigkeiten beschrieben, während kontinuierliche Daten als Mittelwert und 95 %-Konfidenzintervall beschrieben werden, wenn sie normal verteilt sind, oder als Median und Interquartilbereich, wenn sie nicht normal verteilt sind. Die Normalverteilung wird durch den Shapiro-Wilk-Test beurteilt.

Unterschiede im Verhältnis werden durch den exakten Fisher-Test oder den Chi-Quadrat-Test ausgewertet; Der kontinuierliche Variablenvergleich zwischen den drei Gruppen wird mit dem ANOVA-Test (One-Way Analysis Of Variance) für normalverteilte Daten oder mit dem Kruskal-Wallis-Test im Falle einer Nicht-Normalverteilung durchgeführt.

Die Übereinstimmung zwischen molekularen Methoden und der traditionellen Kultur von periprothetischem Gewebe und Synovialflüssigkeit wird anhand von Choens Kappa getestet.

Sensitivität und Spezifität jedes Assays werden ebenfalls bewertet.