Nye molekylære tilgange til diagnosticering af protetiske ledinfektioner

Forsøgspersoner I alt 70 patienter fra afdelingen for rekonstruktiv kirurgi og osteoartikulære infektioner (CRIO) og hoftenhederne på IRCCS Ospedale Galeazzi -Sant'Ambrogio for mistanke om infektion af deres protese vil blive inkluderet i undersøgelsen. Hver prøve vil blive analyseret med både traditionel kultur og Next Generation Sequencing (NGS).

På basis af dyrkningsresultater vil patienter blive opdelt i 3 grupper.

Prøvetagning til molekylær analyse Prøvetagning fra periprotetisk væv med makroskopiske tegn på infektion vil blive taget fra synovialmembranen, knogle-protese-grænsefladen og intramedullære kanaler. Synovialvæske vil blive sterilt opsamlet i DNAse- og RNAse-frie beholdere til NGS-analyse, før artrotomien udføres. Sterile podninger og puder vil blive brugt til at indsamle prøver fra grænsefladen mellem væv og knogleimplantat og fra intramedullær kanal til NGS-analyse. Knoglevæv vil blive opsamlet med nye sterile instrumenter. Prøver vil blive frosset inden for 2 timer fra indsamling ved -80°C indtil .

Prøveindsamling til dyrkning Prøveopsamling af periprostetisk væv og implantat vil blive udført under operationen efter korrekt eksponering af det berørte sted. Synovialvæske vil blive opsamlet i sterile skruelågsrør. Periprostetisk væv og implantat vil blive opsamlet i sterile beholdere ved at bruge nye sterile instrumenter. Alle prøver vil blive sendt til laboratoriet inden for 2 timer efter afhentning. Prøver efter behandling med 0,1% (w:v) Dithiothreitol til at fjerne bakterier fra biofilm vil blive dyrket på agarplader og bouillon til aerobe og anaerobe i 15 dage. Mikrobiel identifikation vil blive udført ved biokemiske assays.

En yderligere vævsprøve, opsamlet i et separat sterilt skruelågsrør, vil blive brugt til værts-DNA-fjernelse for at isolere mikrobielt DNA, til haglgevær-NGS. Prøver vil blive behandlet med saponin og/eller forskellige kommercielle kits til mikrobiel DNA-ekstraktion. dsDNA'et vil blive kvantificeret med et Qubit fluorometer, og dets renhed vil blive bestemt med et nanodrop spektofotometer.

Synovialvæskeanalyse Synovialvæske til leukocyttal og differential vil blive opsamlet i EthylenDiaminoTetraEddikesyre (EDTA)-holdige rør og analyseret ved hjælp af en Sysmex XN hæmatologisk analysator.

Bestemmelse af synovialprotein, glucose, C-Reactive Protein (CRP) og leukocytesterase vil blive udført på ledvæske opsamlet i koagelaktivatorholdige rør. Måling af proteiner, glucose og CRP vil blive udført på Atellica CH og IM analysator (Siemens), mens leukocytesterase blev bestemt ved brug af strips til urinanalyse.

Molekylær analyse 70 prøver vil blive sendt til et specialiseret laboratorium, som vil udføre nukleinsyreekstraktion fra biologiske prøvetyper ved hjælp af skræddersyede proprietære teknikker, der omfatter koncentrering af cellulært materiale, mekanisk lysis og fjernelse af organiske inhibitorer og humant værts-DNA. Hver prøve vil blive behandlet med en positiv og negativ ekstraktionskontrol for at sikre kvaliteten.

Ved afslutningen af ​​undersøgelsen vil eventuelt resterende biologisk materiale blive destrueret

Statistisk metodologi Prøvestørrelse Prøvestørrelsen er blevet beregnet under hensyntagen til som det primære resultat overensstemmelsen mellem den innovative molekylære metode og den traditionelle dyrkning af periprostetisk væv og ledvæske ved at definere en patient som positiv eller negativ for protetiske ledinfektioner. Baseret på efterforskernes erfaring er andelen af ​​patienter, der gennemgår revisionsoperation for knæ- og hofteimplantatsvigt i IRCCS Ospedale Galeazzi Sant'Ambrogio med diagnose af protetisk ledinfektion baseret på kulturel undersøgelse på 45 %. I betragtning af en fejlmargin på 15 %, en alfa = 0,05 og power = 80 %, er antallet af patienter, der skal testes, 70.

Analysemetodologi Kategoriske data vil blive beskrevet som absolutte og relative frekvenser, mens kontinuerlige data vil blive beskrevet som middelværdi og 95 %-konfidensinterval, hvis normalfordelt, eller som median og interkvartilområde, i tilfælde af ikke-normal fordeling. Normalfordelingen vil blive vurderet ved Shapiro-Wilk-testen.

Forskelle i forhold vil blive evalueret af Fishers eksakte test eller Chi-kvadrattest; Kontinuerlig variabel sammenligning mellem de tre grupper vil blive udført ved hjælp af One-Way Analysis Of Variance (ANOVA) test for normalfordelte data eller med Kruskal-Wallis test, i tilfælde af ikke-normal fordeling.

Overensstemmelse mellem molekylære metoder med traditionel dyrkning af periprostetisk væv og ledvæske vil blive testet med Choens kappa.

Sensitivitet og specificitet af hvert assay vil også blive vurderet.