Nuevos enfoques moleculares para el diagnóstico de infección de prótesis articulares

Sujetos Un total de 70 pacientes del Departamento de Cirugía Reconstructiva e Infecciones Osteoarticulares (CRIO) y las Unidades de Cadera del IRCCS Ospedale Galeazzi -Sant'Ambrogio por sospecha de infección de su prótesis se inscribirán en el estudio. Cada muestra será analizada tanto con cultivo tradicional como con Secuenciación de Próxima Generación (NGS).

Según los resultados del cultivo, los pacientes se dividirán en 3 grupos.

Recolección de muestras para análisis molecular Se tomarán muestras de tejido periprotésico con signos macroscópicos de infección de la membrana sinovial, la interfaz hueso-prótesis y los canales intramedulares. El líquido sinovial se recolectará de forma estéril en recipientes libres de ADNasa y ARNasa para análisis NGS antes de realizar la artrotomía. Se utilizarán hisopos y almohadillas estériles para recolectar muestras de la interfaz entre el tejido y el implante óseo y del canal intramedular para el análisis NGS. El tejido óseo se recolectará con instrumentación nueva y estéril. Las muestras se congelarán dentro de las 2 horas posteriores a la recolección a -80 °C hasta .

Recolección de muestras para cultivo La recolección de muestras de tejidos periprotésicos e implantes se realizará durante la cirugía después de la exposición adecuada del sitio afectado. El líquido sinovial se recogerá en tubos estériles con tapa de rosca. Los tejidos periprotésicos y el implante se recogerán en recipientes estériles mediante el uso de instrumentos nuevos y estériles. Todas las muestras se enviarán al Laboratorio dentro de las 2 horas posteriores a su recolección. Las muestras después del tratamiento con ditiotreitol al 0,1% (p:v) para desalojar las bacterias de la biopelícula se cultivarán en placas de agar y caldo para aerobios y anaerobios durante 15 días. La identificación microbiana se realizará mediante ensayos bioquímicos.

Se utilizará una muestra de tejido adicional, recolectada en un tubo con tapa de rosca estéril separado, para eliminar el ADN del huésped y aislar el ADN microbiano, para NGS de escopeta. Las muestras serán tratadas con saponina y/o diferentes kits comerciales para la extracción de ADN microbiano. El dsDNA se cuantificará con un fluorómetro Qubit y su pureza se determinará con un espectrofotómetro de nanogotas.

Análisis del líquido sinovial El líquido sinovial para el recuento y diferencial de leucocitos se recolectará en tubos que contienen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se analizará mediante un analizador hematológico Sysmex XN.

La determinación de proteína sinovial, glucosa, proteína C reactiva (PCR) y esterasa leucocitaria se realizará en líquido sinovial recogido en tubos que contienen activador de coágulos. La medición de proteínas, glucosa y PCR se realizará en el analizador Atellica CH e IM (Siemens), mientras que la esterasa leucocitaria se determinó mediante el uso de tiras para análisis de orina.

Análisis molecular Se enviarán 70 muestras a un laboratorio especializado que realizará la extracción de ácido nucleico de tipos de muestras biológicas utilizando técnicas patentadas personalizadas que incluyen la concentración de material celular, lisis mecánica y eliminación de inhibidores orgánicos y ADN del huésped humano. Cada muestra será procesada con un control de extracción positivo y negativo para asegurar la calidad.

Al final del estudio se destruirá cualquier material biológico residual.

Metodología estadística Tamaño de la muestra El tamaño de la muestra se ha calculado considerando como resultado primario la concordancia del método molecular innovador y el cultivo tradicional de tejido periprotésico y líquido sinovial para definir a un paciente como positivo o negativo para infecciones de prótesis articulares. Según la experiencia de los investigadores, la proporción de pacientes sometidos a una cirugía de revisión por falla de implantes de rodilla y cadera en IRCCS Ospedale Galeazzi Sant'Ambrogio con diagnóstico de infección de prótesis articular basado en un examen cultural es del 45%. Considerando un margen de error del 15%, un alfa = 0,05 y una potencia = 80%, el número de pacientes a evaluar es 70.

Metodología de análisis Los datos categóricos se describirán como frecuencias absolutas y relativas, mientras que los datos continuos se describirán como media e intervalo de confianza del 95%, si se distribuyen normalmente, o como mediana y rango intercuartil, en caso de distribución no normal. La distribución normal se evaluará mediante la prueba de Shapiro-Wilk.

Las diferencias en proporción se evaluarán mediante la prueba exacta de Fisher o la prueba de Chi-cuadrado; La comparación continua de variables entre los tres grupos se realizará mediante la prueba de análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para datos distribuidos normalmente o con la prueba de Kruskal-Wallis, en caso de distribución no normal.

Se probará la concordancia entre los métodos moleculares con el cultivo tradicional de tejido periprotésico y líquido sinovial utilizando la kappa de Choen.

También se evaluará la sensibilidad y especificidad de cada ensayo.