肝臓の脂肪蓄積における糖の役割 (FROGLOSA)

1. はじめに 非アルコール性脂肪肝疾患 (NAFLD) は現在、慢性肝疾患の主な原因であり、世界人口の約 4 分の 1 が罹患しており、この疾患の発生率は依然として増加しています (doi: 10.1210/endrev/bnz009)。 NAFLD の発生は、肥満、インスリン抵抗性、および/または 2 型糖尿病と密接に関連しています (doi: 10.7759/cureus.20776)。 一部の著者は、NAFLD をメタボリックシンドロームの肝臓症状、またはメタボリックシンドローム発症の前兆であるとさえ考えています (doi: 10.1016/j.dld.2014.09.020)。

   NAFLDの発生率の増加は、座りっぱなしのライフスタイル、エネルギー消費量に対して不十分なエネルギー摂取、さらに単純炭水化物（添加糖）の摂取量の増加、特にフルクトース（スクロース分子の一部として、また、特に米国（US）では高果糖コーンシロップ（HFCS）の成分として使用されています）。 過去数十年にわたって、添加糖類（特にフルクトース）の消費量の増加と肥満およびインスリン抵抗性のパンデミックとの関連性を示す多くの論文が発表されてきました（doi: 10.1097/MOL.0b013e3283613bca、 土井: 10.1007/s00394-018-1711-4、土井: 10.1016/j.nut.2013.08.014)。

   しかし、最近のメタ分析では、肥満、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、2 型糖尿病の発症における砂糖やフルクトースの追加摂取量の増加の役割は支持されていません (doi: 10.1017/S0954422414000067, doi: 10.1007/s00394-016-1345-3) ）。 彼らはむしろ、エネルギー摂取量の不適切な増加に関連する場合、添加された糖が有害であることを示唆しています。 フルクトースや添加糖類の摂取量の増加は、不健康なライフスタイルのマーカーである可能性さえ示唆されました。 一方で、脂肪肝の発症における添加糖類、特にフルクトースの役割に関して入手できるデータはそれほど多くありません。

   これは、肝臓におけるグルコース代謝とフルクトース代謝が根本的に異なるという事実によるものと考えられます (doi: 10.1016/j.jada.2010.06.008、doi: 10.3390/nu9091026、doi: 10.1016/j.clnu.2020.12)。 022）。 大部分が肝臓外組織によって代謝されるグルコースとは対照的に、フルクトースのほとんどは肝臓によって直接取り込まれて代謝されます。 さらに、フルクトキナーゼ/ケトヘキソキナーゼによって触媒されるフルクトースのフルクトース-1-リン酸へのリン酸化はフィードバック制御下にないため、トリオソ-3-リン酸が制御されずに生成されます。 これらは糖新生経路に入り、グリコーゲンを補充する（グリコーゲン枯渇状態）ためにさらに使用されますが、新規脂質生成（DNL）の基質を提供し、同時に脂肪酸の酸化を阻害することもできます。 フルクトースは、ステロール制御エレメント結合タンパク質 (SREBP) とともに肝臓の DNL を促進する、炭水化物応答性エレメント結合タンパク質 (ChREBP) 調節経路の強力な活性化因子でもあるようです。

   重要なことは、脂肪組織から放出される脂肪酸が肝臓脂肪の主な供給源であるという事実にもかかわらず、特に NAFLD 患者では、肝臓脂肪蓄積に対する DNL の寄与が大幅に増加することです (doi: 10.1172/JCI23621、doi: 10.1053/j)。 .gastro.2013.11.049）。

   フルクトース摂取が肝脂肪含量（HFC）に及ぼす影響を調べた研究では、明確な結論に達していません。 健康な被験者では、等カロリー条件下でのフルクトース投与は HFC に影響を与えないようです (doi: 10.1093/ajcn/84.6.1374, 土井: 10.1093/ajcn/nqz271)。 健康な被験者の肝臓に脂肪が蓄積するのは、高カロリー、高フルクトース食にさらされた場合のみです (doi: 10.3945/ajcn.2008.27336)。 逆に、腹部肥満の男性は、等カロリーの高果糖食であっても肝臓により多くの脂肪を蓄積しました (doi: 10.1111/joim.12632)。 興味深いことに、等カロリー条件と高カロリー条件の両方で高グルコース食と高フルクトース食を比較した研究では、過体重の男性は高カロリー条件下でのみ肝臓に肝脂肪を蓄積したが、グルコースとフルクトースの間でHFCに対する効果に差は見られなかった(土井: 10.1053/j.gastro.2013.07.012)。

2. パイロットデータ グルコースとフルクトースは肝臓での脂肪の蓄積に異なる影響を与える可能性があり、これは栄養素投与後のHFCの急性変化の研究で実証されています（doi: 10.1093/ajcn/nqy386、doi: 10.26402/jpp.2021.1.05） ）。 これらの研究では、高脂肪および/または単純な炭水化物負荷による肝脂肪の急激な変化を監視できる機能検査を開発および導入しました。 この試験では、脂肪組織の脂肪分解を効果的に抑制するために、実験の開始時に150 gの脂肪が被験者に投与されますが、非エステル化脂肪の抑制によって証明されているように、炭水化物（50 gのフルクトースまたはグルコース）が2時間ごとに投与されます。脂肪酸 (NEFA) 濃度 (doi: 10.1093/ajcn/nqy386)。 このようにして、肝臓脂肪の蓄積に対する脂肪組織からの脂肪酸の影響を制限することができ、その結果生じる変化は食事性脂肪またはDNLの寄与によって説明されるはずです。

   重要なのは、このモデルでは、150 gの脂肪（クリーム）を摂取してから6時間後に、脂肪含量が正常な健康で非肥満の被験者（doi: 10.1093/ajcn/nqy386）と非肥満の被験者の両方でHFCが増加することを示したことです。肝脂肪症の被験者 (doi: 10.26402/jpp.2021.1.05)。 フルクトースを脂肪と同時投与すると、肝脂肪も増加します。 逆に、グルコースと脂肪の同時投与は、HFC のそのような増加を防ぎます (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05)。

3. プロジェクトの理論的根拠 添加された砂糖は、1 日のエネルギー摂取量の 12% 以上を占めます。 肝臓脂肪の蓄積におけるそれらの役割は、これまで純粋なグルコースまたは純粋なフルクトースを用いて研究されてきました。 しかし、実際の生活では、人々は純粋なグルコースやフルクトースを消費するのではなく、スクロースの一部として、または高フルクトースコーンシロップの両方として、グルコースと一緒にフルクトースを消費します。 肝臓の脂肪含有量が両方の糖の混合物にどのように反応するかは完全には明らかではありません。 両方のヘキソースの同時摂取が肝臓での脂肪の蓄積にどのような影響を与えるかという疑問は、実用上非常に重要である可能性があり、この疑問に答えることは、NAFLD 治療のための食事推奨の修正に大きく貢献する可能性があります。

   重要なのは、非肥満、非糖尿病被験者におけるグルコース投与とフルクトース投与に対する HFC の反応の違いを実証できなかったことです (doi: 10.26402/jpp.2021.1.05)。 これら 3 つの糖を高脂肪負荷と同時投与した後、HFC に対する急性の影響を研究することが望ましいでしょう。

   多くの研究が、フルクトースの過剰摂取が代謝の健康に及ぼす悪影響を明確に記録しています。 一方、フルクトースが人間の健康に害を及ぼす場合、フルクトースの制限が HFC に影響を与えるかどうかを知ることが重要になります。 実際、フルクトース制限により、肥満の小児では9日後(doi: 10.1053/j.gastro.2017.05.043)、肥満の個人では6週間後に(doi: 10.1093/ajcn/nqaa332)、肝臓脂肪が大幅に減少しました。 我々のこれまでの結果に基づいて、食事からフルクトースを除去し、デンプンまたはグルコースに置き換えれば、数日であっても肝脂肪含量を効果的に抑制できると仮説が立てられます。

4. 仮説

   2 つの主要な仮説がテストされます。

   • 高脂肪負荷後の肝脂肪含量の増加は、グルコースによって鈍化されますが、フルクトースやスクロースによっては鈍くなりません（プロジェクトのパートA）。
   • 短期 (7 日間) のフルクトース食事制限により、肝臓の脂肪含量が減少します (プロジェクトのパート B)

5. 実験デザイン パート A 研究のこの部分のデザインは、以前の研究のものと同じになります (doi: 10.1093/ajcn/nqy386、doi: 10.26402/jpp.2021.1.05) ただし、磁気共鳴分光法 (MRS) による肝脂肪含量 (HFC) の測定は、各実験中に 2 回だけ実行されます。 研究の各科目について、約 8 時間続く 3 つの試験が実施されます。 まず、肝脂肪含量 (HFC) を MRS を使用して測定します (30 ～ 45 分)。 その後、カニューレが肘前静脈に挿入され、最初の採血が行われます。 次に被験者は、糖類（グルコース/フルクトース/スクロース）のいずれか50gで甘みを付けたフルーツティーと一緒に460mlのクリーム（高脂肪負荷 - 合計150gの脂肪）を摂取します。 2 時間後と 4 時間後に、0 時間時と同じ砂糖で甘くしたフルーツティーを再び受け取ります。 生化学分析用の血液は、0.5、1、2 (お茶の前)、2.5、3、4 (お茶の前)、4.5、5、6 時間後に採取されます。 日中、被験者には食べ物は与えられず、水またはフルーツティーのみを飲むことが許可されます。 肝脂肪含量の測定は 6 時間後に繰り返されます。 磁気共鳴（MR）検査では内臓脂肪の量も測定され、体組成が測定されます。 検査の順序はランダムであり、少なくとも 2 週間の間隔で実施されます。

   被験者: プロジェクトのこの部分では、男性ボランティアの 2 つのグループが研究されます。15 人の非肥満被験者 (BMI) < 30 kg/m2) と 15 人の肥満被験者 (BMI 〜 30 kg/m2) です。 対象者は 18 ～ 70 歳で、グループは年齢に応じて調整されます。 健康な男性被験者を対象とした以前の研究に基づくと、α = 0.05 (両側対応 t 検定) および β = 0.10 での脂肪負荷後の HFC の 10 ± 10% 増加を検出するには、1 グループの被験者数 13 人が十分であるはずです。 。 グループあたりのわずかに高い数は、研究中の一部の被験者の除外または中止に関連するリスクをカバーします。

   両方のグループの除外基準は、糖尿病（空腹時血糖値が 7 mmol/l 以上、oGTT 後の 2 時間血糖値が 11.1 mmol/l 未満、または抗糖尿病治療）、またはその他の重篤な疾患（心血管疾患、癌など）、アルコールです。摂取量 〜 30 g/日、フルクトース不耐症、脂質代謝に影響を与える薬物の使用、および MR 検査の不耐症(閉所恐怖症、金属インプラントなど)。 研究に参加する前に、被験者は研究および遺伝子検査への参加に関するインフォームド・コンセントに署名し、各実験の前にMR検査に関するインフォームド・コンセントに署名します。

   パート B 研究のこのパートに選ばれた被験者は、最初に詳細な 3 日間の食事記録を完成させ、とりわけフルクトース摂取量を定量化することができます。 その後、フルクトースを除去するために食事を変える方法を詳細に指導され、これらの推奨事項も書面で受け取ります。 7日間の食事療法の初日に空腹時に採血され、その後肝脂肪含量がMRSによって測定されます。 その後、食事を補うためにグルコースとフルクトースを含まない厳選された食品のパッケージが提供されます。 その後、7日間、フルクトースを含まない食事を守り、詳細な食事記録を記録します。 介入の最終日に、空腹時に採血され、再び MRS によって HFC が測定されます (正確に 168 時間後)。

   対象者: 18 歳から 70 歳までの 15 人の対象者が研究に含まれます。 パート A と同様に、このような被験者の数は 13 人よりわずかに多く、α = 0.05 (両側一対の t 検定) および β = 0.10 で HFC の 10 ± 10% 減少を検出するのに十分な数です。

   含まれるためには、被験者の肝脂肪含量が脂肪変性グレード 2 に相当する 6.2% 以上 16.5% 未満でなければなりません (doi: 10.1007/s10334-011-0264-9)。 この基準を満たす研究のパート A の参加者はパート B にも含めることができます。除外基準はパート A と同じになります。研究に参加する前に、被験者は研究への参加に関するインフォームドコンセントに署名し、遺伝子検査と各実験の前にMR検査によるインフォームドコンセントに署名します。

6. 方法 MR 分光法 (MRS)。 息止めを伴う標準的な単一ボクセル分光法シーケンス (マルチチャンネル表面ボディコイルを備えた 3 テスラ VIDA シーメンス磁気共鳴 (MR) システム) を使用して肝脂肪含量 (HFC) を測定します。 3 つの解剖学的方向の MR 画像を使用して、対象ボリュームを 40x30x25 mm に設定します。 T2 緩和に対する信号強度の補正が行われます。

   肝臓トリグリセリド (TG) の脂質プロファイルに関する情報を得るために、前述のように MRS スペクトルが分析されます (doi: 10.3390/metabo11090625.)。

   HISTO MR イメージング (MRI)。 プロトン密度脂肪分率 (PDFF) イメージングは​​、食品医薬品局 (FDA) によって承認された HISTO Siemens プロトコルによって測定されます。 これには、分光ディクソン シーケンス、およびマルチエコー ディクソン シーケンスが含まれます。

   データ評価。 MR スペクトルは LCModel (doi: 10.1002/nbm.698) を使用して評価されます。 MRS によって評価される HFC の割合は、Longo (doi: 10.1002/jmri.1880050311) に従って計算されます。

   MR画像による内臓脂肪量測定。 PDFF測定の前後にターボスピンエコーシーケンスにより内臓脂肪含量を測定します。 内臓脂肪と皮下脂肪の体積を評価するには、MATLAB で作成されたソフトウェアが使用されます。 オペレーターの影響を軽減するために、内臓脂肪面積は 2 人の独立した専門家によって評価されます。

   身体組成。 検査時の体組成はInBodyを用いて測定されます。

   生化学分析。 血液は必要なすべての阻害剤を含むチューブに採取され、すぐに氷上に置かれ、遠心分離されて 15 分以内に血漿が採取されます。 研究で得られたすべてのサンプルで、グルコース、トリグリセリド (TG)、非エステル化脂肪酸 (NEFA)、インスリン、β-ヒドロキシ酪酸が測定されます。 これらのパラメータを決定するために必要な生化学法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）法はすべて、出願人の研究室で現在使用されている。

   リピドミクス。 VLDL は超遠心分離によって分離され、VLDL トリグリセリドと血漿遊離脂肪酸の脂肪酸プロファイルの分析は、チェコ アカデミー生理学研究所のメタボロミクス部門で液体クロマトグラフィー - 質量分析 (LC-MS) によって実行されます。科学（有料サービス）。

   遺伝学。 肝臓脂肪の蓄積に影響を与えることが知られている遺伝子多型（PNPLA、TM6SF2など）が特定されます。

   統計。 統計データの分析と相関関係は、PRISM 9.1 または JMP ソフトウェアを使用して実行されます。

7. 2024 年のプロジェクトのタイムスケジュール: パート A: 学習計画書の作成、科目の検索とスクリーニング、最初の科目の学習試験の開始 - 合計 90 の試験のうち約 20 の終日試験が実施されます (試験ごとに 3 つの試験) 30科目）。 研究可能な被験者の数は、研究研究用の MR 断層撮影装置の利用可能性 (週 1 日) と検査の複雑さによって制限されます。 基本的な生化学分析は継続的に実行されますが、各被験者からのすべてのサンプル（合計 30 個）は -80°C で保存され、同時に分析されます。

パート B: フルクトース摂取量の定量化に使用できる研究プロトコルと食事記録の準備。 被験者の検索とスクリーニング。

2025: パート A: 科目のスクリーニング、学習試験 - 分 終日検査は30件実施されます。 生化学分析の継続。

パート B: 被験者のスクリーニング (パート A で研究された脂肪肝症の被験者もパート B に含めることができます)。 食事介入実験（約 n=20) で約 対象者 10 名（介入初日と最終日の MR 検査と一晩の VLDL 分離を含め、週に 1 名の対象が介入可能）。 生化学分析。

2026: パート A: 科目のスクリーニング、学習試験 - 分 終日検査は30件実施されます。 生化学分析の継続。 集中的なデータ分析の開始。

パート B: 被験者のスクリーニング。 介入の初日と最終日に残りの被験者を対象とした食事介入実験 (n = 10)。 生化学分析。 特殊な生化学分析 (例: 線維芽細胞増殖因子 19 (FGF-19)、新規脂質生成の制御に関与する可能性のある選択されたヘパトカインまたはその他のタンパク質の ELISA) および遊離脂肪酸 (FFA) プールの脂肪酸プロファイルのリピドミクス分析VLDLのTG。 データの分析と結果の公表。

2027: パート A: 残りの科目の学習試験 - 最大 2027 年終日検査は10回実施されます。 日常的な生化学分析の継続。 特殊な生化学分析 (上記を参照)。 データの分析と結果の公表。

パート B: データの最終分析と結果の公表。

8. 期待される結果 このプロジェクトは、単純な炭水化物が肝脂肪の蓄積に影響を与えるメカニズムについての新たな洞察を提供します。 特に重要なのは、フルクトースとグルコース（集中的に研究されているが、国民の間では使用されていない）の役割と、一般的に国民全体で甘味を与えるために使用される砂糖であるスクロースの役割を比較することである。 さらに、食事からのフルクトース制限に関する実験は、そのような介入が脂肪肝症の治療に有用であるかどうかを判断する必要があります。 全体として、プロジェクトの両方の部分は、実践的な食事の推奨事項として実施できる結果を提供し、NAFLD の管理戦略を改善する必要があります。