Il ruolo degli zuccheri nell'accumulo di grasso nel fegato (FROGLOSA)

1. INTRODUZIONE La steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è attualmente la principale causa di malattia epatica cronica, colpisce circa un quarto della popolazione mondiale e l'incidenza della malattia è ancora in aumento (doi: 10.1210/endrev/bnz009). L'insorgenza della NAFLD è strettamente associata all'obesità, alla resistenza all'insulina e/o al diabete di tipo 2 (doi: 10.7759/cureus.20776). Alcuni autori considerano addirittura la NAFLD una manifestazione epatica della sindrome metabolica o addirittura il precursore dello sviluppo della sindrome metabolica (doi: 10.1016/j.dld.2014.09.020).

   La crescente incidenza della NAFLD è stata attribuita allo stile di vita sedentario, all’apporto energetico inadeguato al dispendio energetico e anche all’aumento dell’assunzione di carboidrati semplici (zuccheri aggiunti) e, in particolare, all’aumento dell’assunzione di fruttosio (sia come parte della molecola di saccarosio che come parte della molecola di saccarosio). , soprattutto negli Stati Uniti (US), come componente dello sciroppo di mais ad alto contenuto di fruttosio (HFCS)). Negli ultimi decenni sono stati presentati numerosi studi che hanno dimostrato un legame tra l’aumento del consumo di zuccheri aggiunti (soprattutto di fruttosio) e la pandemia di obesità e resistenza all’insulina (doi: 10.1097/MOL.0b013e3283613bca, doi: 10.1007/s00394-018-1711-4, doi: 10.1016/j.nut.2013.08.014).

   Tuttavia, recenti meta-analisi non hanno supportato il ruolo dell’aumento dell’assunzione di zuccheri aggiunti o di fruttosio nello sviluppo di obesità, resistenza all’insulina, sindrome metabolica e diabete di tipo 2 (doi: 10.1017/S0954422414000067, doi: 10.1007/s00394-016-1345-3 ). Suggeriscono piuttosto che gli zuccheri aggiunti siano dannosi se associati ad un apporto energetico non adeguatamente aumentato. È stato anche suggerito che un aumento del consumo di fruttosio/zuccheri aggiunti potrebbe essere un indicatore di uno stile di vita non sano. Non sono invece disponibili molti dati riguardo al ruolo degli zuccheri aggiunti e, in particolare, del fruttosio, nello sviluppo del fegato grasso.

   Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che il metabolismo del glucosio e del fruttosio nel fegato è fondamentalmente diverso (doi: 10.1016/j.jada.2010.06.008, doi: 10.3390/nu9091026, doi: 10.1016/j.clnu.2020.12. 022). Contrariamente al glucosio, che viene in gran parte metabolizzato dai tessuti extraepatici, la maggior parte del fruttosio viene assorbito e metabolizzato direttamente dal fegato. Inoltre, la fosforilazione del fruttosio in fruttosio-1-fosfato catalizzata dalla fruttochinasi/chetoesochinasi non è soggetta ad alcun controllo di feedback e determina una produzione incontrollata di trioso-3-fosfati. Questi possono entrare nel percorso della gluconeogenesi ed essere ulteriormente utilizzati per ricostituire il glicogeno (in stato di deplezione di glicogeno), ma possono anche fornire un substrato per la lipogenesi de novo (DNL) e, allo stesso tempo, inibire l'ossidazione degli acidi grassi. Il fruttosio sembra essere anche un potente attivatore del percorso regolatorio della proteina legante gli elementi responsivi ai carboidrati (ChREBP) che, insieme alla proteina legante gli elementi regolatori degli steroli (SREBP), promuove il DNL nel fegato.

   È importante sottolineare che, nonostante il fatto che gli acidi grassi rilasciati dal tessuto adiposo siano la principale fonte di grasso epatico, il contributo del DNL all’accumulo di grasso epatico aumenta significativamente in particolare nei pazienti con NAFLD (doi: 10,1172/JCI23621, doi: 10,1053/j .gastro.2013.11.049).

   Gli studi che esaminano l’effetto del consumo di fruttosio sul contenuto di grassi epatici (HFC) non sono giunti a una conclusione chiara. In soggetti sani, la somministrazione di fruttosio in condizioni isocaloriche non sembra avere alcun impatto sugli HFC (doi: 10.1093/ajcn/84.6.1374, doi: 10.1093/ajcn/nqz271). Grasso accumulato nel fegato di soggetti sani solo quando esposti a una dieta ipercalorica ad alto contenuto di fruttosio (doi: 10.3945/ajcn.2008.27336). Al contrario, gli uomini con obesità addominale hanno accumulato più grasso nel fegato anche con una dieta isocalorica ad alto contenuto di fruttosio (doi: 10.1111/joim.12632). È interessante notare che, nello studio che ha confrontato una dieta ad alto contenuto di glucosio e ad alto contenuto di fruttosio sia in condizioni iso- che ipercaloriche, gli uomini in sovrappeso hanno accumulato grasso epatico nel fegato solo in condizioni ipercaloriche, ma non è stata riscontrata alcuna differenza nell’effetto sull’HFC tra glucosio e fruttosio ( doi: 10.1053/j.gastro.2013.07.012).

2. DATI PILOTA Il glucosio e il fruttosio possono avere effetti diversi sull'accumulo di grasso nel fegato, come abbiamo dimostrato nei nostri studi sui cambiamenti acuti dell'HFC dopo la somministrazione di nutrienti (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05 ). In questi studi abbiamo sviluppato e introdotto un test funzionale che ci ha permesso di monitorare i cambiamenti acuti nel grasso epatico dopo un carico elevato di grassi e/o carboidrati semplici. Nel test, 150 g di grassi vengono somministrati ai soggetti all'inizio dell'esperimento, mentre i carboidrati (50 g di fruttosio o glucosio) vengono somministrati ogni 2 ore per sopprimere efficacemente la lipolisi nel tessuto adiposo, come documentato dalla soppressione dei grassi non esterificati concentrazione di acidi grassi (NEFA) (doi: 10,1093/ajcn/nqy386). In questo modo possiamo limitare l'impatto degli acidi grassi del tessuto adiposo sull'accumulo di grasso epatico e i cambiamenti risultanti dovrebbero essere spiegati dal contributo dei grassi alimentari o DNL.

   È importante sottolineare che in questo modello abbiamo dimostrato che 6 ore dopo il consumo di 150 g di grassi (panna), l'HFC aumenta sia nei soggetti sani non obesi con contenuto di grassi normale (doi: 10,1093/ajcn/nqy386) sia anche nei soggetti non obesi. soggetti con epatosteatosi (doi: 10.26402/jpp.2021.1.05). Il grasso epatico aumenta anche quando il fruttosio viene co-somministrato con i grassi. Al contrario, la co-somministrazione di glucosio e grassi impedisce un tale aumento di HFC (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05).

3. IL MOTIVO DEL PROGETTO Gli zuccheri aggiunti rappresentano oltre il 12% dell'apporto energetico giornaliero. Il loro ruolo nell'accumulo di grasso nel fegato è stato finora studiato con glucosio puro o fruttosio puro. Tuttavia, nella vita reale le persone non consumano glucosio o fruttosio puro, ma consumano fruttosio insieme al glucosio sia come parte del saccarosio che nello sciroppo di mais ad alto contenuto di fruttosio. Non è del tutto chiaro come il contenuto di grassi epatici risponderà alla miscela di entrambi gli zuccheri. La questione di come il consumo contemporaneo di entrambi gli esosi influenzi l’accumulo di grasso nel fegato può avere un grande significato pratico e rispondere a questa domanda potrebbe contribuire notevolmente alla modifica delle raccomandazioni dietetiche per il trattamento della NAFLD.

   È importante sottolineare che, poiché non siamo stati in grado di dimostrare la differenza tra la risposta dell'HFC alla somministrazione di glucosio e quella di fruttosio in soggetti non obesi e non diabetici (doi: 10.26402/jpp.2021.1.05), sarebbe preferibile studiare gli effetti acuti di questi tre zuccheri sull'HFC dopo la loro co-somministrazione con un carico elevato di grassi.

   Numerosi studi hanno chiaramente documentato gli effetti negativi del consumo eccessivo di fruttosio sulla salute metabolica. D’altra parte, se il fruttosio danneggiasse la salute umana, sarebbe importante sapere se la restrizione del fruttosio ha un effetto sull’HFC. Infatti, la restrizione del fruttosio ha portato a una riduzione significativa del grasso epatico dopo 9 giorni nei bambini obesi (doi: 10.1053/j.gastro.2017.05.043) e dopo 6 settimane negli individui obesi (doi: 10.1093/ajcn/nqaa332). Sulla base dei nostri risultati precedenti, si può ipotizzare che eliminando il fruttosio dalla dieta e sostituendolo con amido o glucosio dovrebbe effettivamente sopprimere il contenuto di grassi epatici anche in pochi giorni.

4. IPOTESI

   Verranno verificate due ipotesi principali:

   • L'aumento del contenuto di grassi epatici dopo un carico elevato di grassi è attenuato dal glucosio ma non dal fruttosio né dal saccarosio (Parte A del progetto).
   • La restrizione alimentare di fruttosio a breve termine (7 giorni) determina una diminuzione del contenuto di grassi epatici (Parte B del progetto)

5. DISEGNO SPERIMENTALE Parte A Il disegno di questa parte dello studio sarà lo stesso di quello dei nostri studi precedenti (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05) tranne che durante ciascun esperimento verranno effettuate solo due misurazioni del contenuto di grasso epatico (HFC) mediante spettroscopia di risonanza magnetica (MRS). I tre esami della durata di circa 8 ore verranno svolti in ciascuna materia dello studio. Innanzitutto, il contenuto di grasso epatico (HFC) sarà misurato mediante MRS (30-45 minuti). La cannula verrà poi inserita nella vena antecubitale e verrà effettuato il primo prelievo di sangue. I soggetti riceveranno quindi 460 ml di panna (alto carico di grassi - 150 g di grassi in totale) con tè alla frutta addolcito con 50 g di uno degli zuccheri (glucosio/fruttosio/saccarosio). Due e quattro ore dopo riceveranno nuovamente il tè alla frutta zuccherato con lo stesso zucchero del tempo 0 h. Il sangue per le analisi biochimiche verrà poi prelevato alle ore 0,5, 1, 2 (prima del tè), 2,5, 3, 4 (prima del tè), 4,5, 5 e 6 ore. Durante la giornata i soggetti non riceveranno alcun cibo e potranno bere solo acqua o tisane alla frutta. La misurazione del contenuto di grasso epatico verrà ripetuta dopo 6 ore. Durante l'esame di risonanza magnetica (RM) verrà misurato anche il volume del grasso viscerale e verrà determinata la composizione corporea. L'ordine degli esami sarà randomizzato e verranno eseguiti ad intervalli di almeno due settimane.

   Soggetti: in questa parte del progetto verranno studiati due gruppi di volontari maschi: 15 soggetti non obesi (indice di massa corporea (BMI) < 30 kg/m2) e 15 soggetti obesi (BMI ˃ 30 kg/m2). I soggetti avranno un'età compresa tra 18 e 70 anni e i gruppi saranno abbinati per età. Sulla base dei nostri studi precedenti con soggetti maschi sani, il numero di 13 soggetti in un gruppo dovrebbe essere sufficiente per rilevare un incremento del 10 ± 10% nell'HFC dopo il carico di grassi a α = 0,05 (test t accoppiato a due code) e β = 0,10 . Il numero leggermente più alto per gruppo copre i rischi associati all'esclusione o al ritiro di alcuni soggetti durante lo studio.

   I criteri di esclusione per entrambi i gruppi saranno il diabete mellito (glicemia a digiuno superiore a 7 mmol/l, glicemia a 2 ore dopo oGTT ˃ 11,1 mmol/l o trattamento antidiabetico) o altre malattie gravi (malattie cardiovascolari, cancro, ecc.), alcol consumo ˃ 30 g/die, intolleranza al fruttosio, uso di farmaci che influenzano il metabolismo dei lipidi e intolleranza all'esame RM (claustrofobia, protesi metalliche, ecc.). Prima dell'ingresso nello studio i soggetti firmeranno i consensi informati con la partecipazione allo studio e ai test genetici e prima di ogni esperimento firmeranno il consenso informato con l'esame RM.

   Parte B I soggetti selezionati per questa parte dello studio completeranno innanzitutto un registro alimentare dettagliato di tre giorni che ci permetterà di quantificare, tra le altre cose, il loro consumo di fruttosio. Verranno poi istruiti dettagliatamente su come modificare la loro dieta per eliminare il fruttosio e riceveranno queste raccomandazioni anche per iscritto. Il primo giorno dell'intervento dietetico di sette giorni, verrà prelevato il sangue a digiuno e quindi il contenuto di grasso epatico sarà misurato mediante MRS. Successivamente riceveranno un pacchetto di glucosio e alimenti selezionati senza fruttosio per integrare la loro dieta. Per sette giorni seguiranno poi una dieta senza fruttosio e terranno un registro dietetico dettagliato. L'ultimo giorno dell'intervento verrà prelevato il sangue a digiuno e misurato nuovamente l'HFC mediante MRS (dopo 168 ore esatte).

   Soggetti: Quindici soggetti di età compresa tra 18 e 70 anni saranno inclusi nello studio. Analogamente alla Parte A, il numero di soggetti è leggermente superiore a 13, un numero sufficiente per rilevare una diminuzione del 10 ± 10% dell'HFC a α = 0,05 (test t accoppiato a due code) e β = 0,10.

   Per essere incluso, il contenuto di grassi epatici nei soggetti deve essere superiore al 6,2% e inferiore al 16,5% che corrisponde al grado di steatosi 2 (doi: 10.1007/s10334-011-0264-9). I partecipanti della Parte A dello studio che soddisfano questo criterio possono essere inclusi anche nella Parte B. I criteri di esclusione saranno gli stessi della Parte A. Prima dell'ingresso nello studio, i soggetti firmeranno i consensi informati con la partecipazione allo studio e test genetici e prima di ogni esperimento firmeranno il consenso informato con esame RM.

6. METODI Spettroscopia RM (MRS). La sequenza standard di spettroscopia a voxel singolo con apnea (sistema di risonanza magnetica (MR) VIDA Siemens da 3 Tesla dotato di bobina di superficie multicanale) verrà utilizzata per misurare il contenuto di grasso epatico (HFC). Verranno utilizzate immagini RM in tre orientamenti anatomici per impostare il volume di interesse di 40x30x25 mm. Verrà effettuata la correzione delle intensità del segnale al rilassamento T2.

   Per ottenere informazioni sul profilo lipidico dei trigliceridi epatici (TG), gli spettri MRS verranno analizzati come descritto in precedenza (doi: 10.3390/metabo11090625.).

   Imaging HISTO RM (MRI). L'imaging della frazione grassa della densità protonica (PDFF) sarà misurato mediante il protocollo HISTO Siemens approvato dalla Food and Drug Administration (FDA). Comprende sequenze spettroscopiche, Dixon e multieco Dixon.

   Valutazione dei dati. Gli spettri RM verranno valutati utilizzando il modello LC (doi: 10.1002/nbm.698) e la percentuale di HFC valutata da MRS sarà calcolata secondo Longo (doi: 10.1002/jmri.1880050311).

   Misurazione del contenuto di grasso viscerale mediante imaging RM. Il contenuto di grasso viscerale sarà misurato mediante sequenza turbo spin echo prima o dopo la misurazione del PDFF. Per valutare il volume del grasso viscerale e sottocutaneo verrà utilizzato un software scritto in MATLAB. Per ridurre l'impatto dell'operatore, le aree di grasso viscerale verranno valutate da due esperti indipendenti.

   Composizione corporea. La composizione corporea durante lo screening sarà determinata utilizzando InBody.

   Analisi biochimica. Il sangue verrà raccolto in provette contenenti tutti gli inibitori necessari, immediatamente posti sul ghiaccio e centrifugati per raccogliere il plasma entro 15 minuti. In tutti i campioni ottenuti nello studio verranno misurati il ​​glucosio, i trigliceridi (TG), gli acidi grassi non esterificati (NEFA), l'insulina e il β-idrossibutirrato. Tutti i metodi biochimici, radioimmunologici (RIA) e immunoassorbenti legati a enzimi (ELISA) necessari per la determinazione di questi parametri sono attualmente in uso nei laboratori dei richiedenti.

   Lipidomica. Le VLDL saranno isolate mediante ultracentrifugazione e l'analisi del profilo degli acidi grassi dei trigliceridi VLDL e degli acidi grassi liberi plasmatici sarà effettuata mediante cromatografia liquida - spettrometria di massa (LC-MS) nel dipartimento di Metabolomica dell'Istituto di Fisiologia, Accademia Ceca di Scienze (servizio a pagamento).

   Genetica. Verranno determinati i polimorfismi dei geni (PNPLA, TM6SF2 e altri) noti per influenzare l'accumulo di grasso nel fegato.

   Statistiche. L'analisi statistica dei dati e le correlazioni verranno eseguite con il software PRISM 9.1 o JMP.

7. CALENDARIO DEL PROGETTO 2024: Parte A: Preparazione dei protocolli di studio, ricerca e screening dei soggetti, avvio degli esami dello studio nelle prime materie - verranno effettuati circa 20 esami nell'intera giornata su 90 esami totali (3 esami per ciascuna di 30 soggetti). Il numero di soggetti che possono essere studiati è limitato dalla disponibilità del tomografo RM per studi di ricerca (1 giorno a settimana) e dalla complessità degli esami. Le analisi biochimiche di base verranno eseguite in continuo, ma tutti i campioni di ciascun soggetto (30 in totale) verranno conservati a -80°C e analizzati simultaneamente.

Parte B: Preparazione di protocolli di studio e registri dietetici che possono essere utilizzati per quantificare il consumo di fruttosio. Ricerca e screening dei soggetti.

2025: Parte A: Screening delle materie, esami di studio - min. Verranno effettuati 30 esami nell'arco di una giornata. Continuazione delle analisi biochimiche.

Parte B: Screening dei soggetti (i soggetti con epatosteatosi studiati nella Parte A possono essere inclusi anche nella Parte B). Esperimenti di intervento dietetico (ca. n=20) in ca. 10 soggetti (è possibile intervenire 1 soggetto a settimana, compreso esame RM e isolamento notturno delle VLDL nel primo e nell'ultimo giorno di intervento). Analisi biochimiche.

2026: Parte A: Screening delle materie, esami di studio - min. Verranno effettuati 30 esami nell'arco di una giornata. Continuazione delle analisi biochimiche. Inizio dell'analisi intensiva dei dati.

Parte B: Selezione dei soggetti. Esperimenti di intervento dietetico (n = 10) nei restanti soggetti il ​​primo e l'ultimo giorno di intervento. Analisi biochimiche. Analisi biochimiche specializzate (ad esempio ELISA per il fattore di filatura dei fibroblasti 19 (FGF-19), epatochine selezionate o altre proteine ​​che possono essere coinvolte nella regolazione della lipogenesi de novo) e analisi lipidomiche del profilo degli acidi grassi nel pool di acidi grassi liberi (FFA) e TG nelle VLDL. Analisi dei dati e pubblicazione dei risultati.

2027: Parte A: Esami di studio nelle restanti materie - max. Verranno effettuati 10 esami nell'arco di una giornata intera. Continuazione delle analisi biochimiche di routine. Analisi biochimiche specializzate (vedi sopra). Analisi dei dati e pubblicazione dei risultati.

Parte B: Analisi finale dei dati e pubblicazione dei risultati.

8. RISULTATI ATTESI Questo progetto fornirà nuove conoscenze sui meccanismi attraverso i quali i carboidrati semplici influenzano l'accumulo di grasso nel fegato. Di particolare importanza sarà il confronto tra il ruolo del fruttosio e del glucosio (che sono intensamente studiati ma non utilizzati dalla popolazione) e quello del saccarosio, lo zucchero generalmente utilizzato per dolcificare da tutta la popolazione. Inoltre, l'esperimento con la restrizione del fruttosio dalla dieta dovrebbe determinare se tale intervento può essere utile per il trattamento dell'epatosteatosi. Nel complesso, entrambe le parti dei progetti dovrebbero fornire risultati che possano essere implementati in raccomandazioni dietetiche pratiche e migliorare le strategie di gestione della NAFLD.