Sukkers rolle i fettakkumulering i leveren (FROGLOSA)

1. INNLEDNING Ikke-alkoholisk fettleversykdom (NAFLD) er for tiden den ledende årsaken til kronisk leversykdom, den rammer omtrent en fjerdedel av den globale befolkningen og forekomsten av sykdommen er fortsatt økende (doi: 10.1210/endrev/bnz009). Forekomsten av NAFLD er tett assosiert med fedme, insulinresistens og/eller type 2 diabetes (doi: 10.7759/cureus.20776). Noen forfattere anser til og med at NAFLD er levermanifestasjon av metabolsk syndrom eller til og med forløperen til utvikling av metabolsk syndrom (doi: 10.1016/j.dld.2014.09.020).

   Den økende forekomsten av NAFLD har blitt tilskrevet stillesittende livsstil, energiinntak utilstrekkelig til energiforbruk og også til økt inntak av enkle karbohydrater (tilsatt sukker), og spesifikt økt inntak av fruktose (både som en del av sukrosemolekylet og også , spesielt i USA (USA), som en komponent av høyfruktose maissirup (HFCS)). I løpet av de siste tiårene har det blitt presentert en rekke artikler som har vist en sammenheng mellom økt forbruk av tilsatt sukker (spesielt fruktose) og fedme- og insulinresistens-pandemien (doi: 10.1097/MOL.0b013e3283613bca, doi: 10.1007/s00394-018-1711-4, doi: 10.1016/j.nut.2013.08.014).

   Nyere metaanalyser har imidlertid ikke støttet rollen til økt tilsatt sukker eller fruktoseinntak i utviklingen av fedme, insulinresistens, metabolsk syndrom og type 2 diabetes (doi: 10.1017/S0954422414000067, doi: 10.1007/s006394-1351-13451-1351-1301 ). De antyder heller at tilsatt sukker er skadelig hvis det er forbundet med utilstrekkelig økt energiinntak. Det ble til og med antydet at økt forbruk av fruktose/tilsatt sukker kan være en markør for usunn livsstil. På den annen side er det ikke så mange data tilgjengelig med hensyn til rollen til tilsatt sukker og spesifikt fruktose, i utviklingen av fettlever.

   Dette kan skyldes at metabolismen av glukose- og fruktosemetabolismen i leveren er fundamentalt forskjellig (doi: 10.1016/j.jada.2010.06.008, doi: 10.3390/nu9091026, doi: 10.1016/j.cl.020.cl. 022). I motsetning til glukose, som i stor grad metaboliseres av ekstrahepatisk vev, blir mesteparten av fruktose direkte tatt opp og metabolisert av leveren. Dessuten er fosforylering av fruktose til fruktose-1-fosfat katalysert av fruktokinase/ketoheksokinase ikke under noen tilbakemeldingskontroll og resulterer i ukontrollert produksjon av trioso-3-fosfater. Disse kan gå inn i glukoneogeneseveien og brukes videre til å fylle opp glykogen (i tilstand av glykogenutarming), men de kan også gi et substrat for de novo lipogenese (DNL) og samtidig hemme fettsyreoksidasjon. Fruktose ser også ut til å være en potent aktivator av karbohydrat-responsivt element-bindende protein (ChREBP) regulatorisk vei som sammen med sterol regulatorisk element-bindende protein (SREBP) fremmer DNL i leveren.

   Viktigere, til tross for det faktum at fettsyrer frigjort fra fettvev er hovedkilden til leverfettet, øker bidraget fra DNL til leverfettakkumulering betydelig spesifikt hos pasienter med NAFLD (doi: 10.1172/JCI23621, doi: 10.1053/j .gastro.2013.11.049).

   Studier som ser på effekten av fruktoseforbruk på hepatisk fettinnhold (HFC) har ikke kommet til en klar konklusjon. Hos friske personer ser det ikke ut til at administrasjon av fruktose under isokaloriske forhold har noen innvirkning på HFC (doi: 10.1093/ajcn/84.6.1374, doi: 10.1093/ajcn/nqz271). Fett akkumuleres i leveren til friske forsøkspersoner bare når de ble utsatt for et hyperkalorisk høy-fruktosediett (doi: 10.3945/ajcn.2008.27336). Tvert imot akkumulerte abdominalt overvektige menn mer fett i leveren selv på en isokalorisk høy-fruktosediett (doi: 10.1111/joim.12632). Interessant nok, i studien som sammenlignet en diett med høy glukose og høy fruktose under både iso- og hyperkaloriske forhold, akkumulerte overvektige menn leverfett i leveren kun under hyperkaloriske forhold, men ingen forskjell i effekten på HFC ble funnet mellom glukose og fruktose ( doi: 10.1053/j.gastro.2013.07.012).

2. PILOTDATA Glukose og fruktose kan ha ulike effekter på akkumulering av fett i leveren som vi har påvist i våre studier av akutte endringer av HFC etter næringstilførsel (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.20521. ). I disse studiene utviklet og introduserte vi en funksjonstest som tillot oss å overvåke akutte endringer i leverfett etter en utfordring med høy fett og/eller enkel karbohydratmengde. I testen blir de 150 g fettet administrert til forsøkspersonene i begynnelsen av eksperimentet, mens karbohydrater (50 g fruktose eller glukose) administreres hver 2. time for effektivt å undertrykke lipolysen i fettvev som dokumentert ved undertrykkelse av ikke-forestret fettsyrer (NEFA) konsentrasjon (doi: 10.1093/ajcn/nqy386). På denne måten kan vi begrense virkningen av fettsyrer fra fettvevet på akkumulering av leverfett, og de resulterende endringene bør forklares med bidrag fra diettfett eller DNL.

   Viktigere, i denne modellen har vi vist at 6 timer etter inntak av 150 g fett (krem), øker HFC hos både friske ikke-overvektige personer med normalt fettinnhold (doi: 10.1093/ajcn/nqy386) og også hos ikke-overvektige personer med hepatosteatose (doi: 10.26402/jpp.2021.1.05). Leverfett øker også når fruktose gis samtidig med fett. Tvert imot forhindrer samtidig administrering av glukose med fett en slik økning i HFC (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05).

3. PROSJEKTETS RASIONAL Tilsatte sukkerarter utgjør mer enn 12 % av det daglige energiinntaket. Deres rolle i akkumulering av leverfett har blitt studert så langt med ren glukose eller ren fruktose. Men i det virkelige liv bruker folk ikke ren glukose eller fruktose, de bruker fruktose sammen med glukose både som en del av sukrose eller i høyfruktose maissirup. Det er ikke helt klart hvordan fettinnholdet i leveren vil reagere på blandingen av begge sukkerarter. Spørsmålet om hvordan samtidig inntak av begge heksosene påvirker akkumuleringen av fett i leveren kan være av stor praktisk betydning, og å svare på dette spørsmålet kan i stor grad bidra til å modifisere kostholdsanbefalingene for NAFLD-behandling.

   Viktigere, siden vi ikke var i stand til å demonstrere forskjellen mellom responsen til HFC på glukose- og fruktoseadministrasjon hos ikke-overvektige ikke-diabetikere (doi: 10.26402/jpp.2021.1.05), det vil være å foretrekke å studere de akutte effektene av disse tre sukkerene på HFC etter samtidig administrering med høy fettmengde.

   Antall studier dokumenterte klart negative effekter av overdreven fruktoseforbruk på metabolsk helse. På den annen side, hvis fruktose skader menneskers helse, vil det være viktig å vite om fruktosebegrensning har en effekt på HFC. Faktisk førte fruktosebegrensning til en betydelig reduksjon i leverfett etter 9 dager hos overvektige barn (doi: 10.1053/j.gastro.2017.05.043) og etter 6 uker hos overvektige individer (doi: 10.1093/ajcn/nqaa332). Basert på våre tidligere resultater, kan det antas at å eliminere fruktose fra kostholdet og erstatte det med stivelse eller glukose effektivt bør undertrykke leverfettinnholdet selv i løpet av noen få dager.

4. HYPOTESER

   To hovedhypoteser vil bli testet:

   • Økningen i leverens fettinnhold etter høy fettbelastning blir sløvet av glukose, men ikke fruktose eller sukrose (del A av prosjektet).
   • Den kortsiktige (7 dager) diettfruktoserestriksjonen resulterer i en reduksjon av leverfettinnholdet (del B av prosjektet)

5. EKSPERIMENTELL DESIGN Del A Utformingen av denne delen av studien vil være den samme som i våre tidligere studier (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05) bortsett fra at kun to målinger av leverfettinnhold (HFC) ved magnetisk resonansspektroskopi (MRS) vil bli utført under hvert eksperiment. De tre eksamenene på ca. 8 timer vil bli gjennomført i hvert emne i studiet. Først vil hepatisk fettinnhold (HFC) bli målt ved hjelp av MRS (30-45 minutter). Kanylen vil deretter settes inn i antecubitalvenen og den første blodprøven vil bli utført. Forsøkspersonene vil da motta 460 ml krem ​​(høy fettmengde - 150 g fett totalt) med fruktte søtet med 50 g av ett av sukkerartene (glukose/fruktose/sukrose). To og fire timer senere vil de få igjen fruktte søtet med samme sukker som på tidspunktet 0 timer. Blodet for biokjemiske analyser tas deretter etter 0,5, 1, 2 (før te), 2,5, 3, 4 (før te), 4,5, 5 og 6 timer. I løpet av dagen vil forsøkspersonene ikke få noe mat, og de får bare drikke vann eller fruktte. Målingen av leverfettinnholdet gjentas etter 6 timer. Under magnetisk resonans (MR) undersøkelse vil volumet av visceralt fett også bli målt og kroppssammensetningen vil bli bestemt. Rekkefølgen på undersøkelsene vil bli randomisert og de gjennomføres med minst to ukers mellomrom.

   Emner: To grupper av mannlige frivillige vil bli studert i denne delen av prosjektet - 15 ikke-overvektige forsøkspersoner (Body Mass Index (BMI) < 30 kg/m2) og 15 overvektige forsøkspersoner (BMI ˃ 30 kg/m2). Fagene vil være 18 - 70 år og grupper vil være alderstilpasset. Basert på våre tidligere studier med friske mannlige forsøkspersoner skulle antallet 13 forsøkspersoner i én gruppe være tilstrekkelig til å oppdage 10 ± 10 % økning i HFC etter fettbelastningen ved α = 0,05 (to-sidet paret t-test) og β = 0,10 . Det litt høyere antallet per gruppe dekker risikoen forbundet med ekskludering eller tilbaketrekking av enkelte forsøkspersoner under studien.

   Eksklusjonskriteriene for begge gruppene vil være diabetes mellitus (fastende glukose over 7 mmol/l, 2-timers glukose etter oGTT ˃ 11,1 mmol/l, eller antidiabetisk behandling) eller andre alvorlige sykdommer (hjerte- og karsykdommer, kreft osv.), alkohol forbruk ˃ 30 g/dag, fruktoseintoleranse, bruk av legemidler som påvirker lipidmetabolismen og intoleranse ved MR-undersøkelse (klaustrofobi, metallimplantater osv.). Før inntreden i studien vil forsøkspersonene signere det informerte samtykket med deltakelse i studien og genetiske tester, og før hvert eksperiment vil de signere det informerte samtykket med MR-undersøkelse.

   Del B Emner valgt for denne delen av studien vil først fullføre en detaljert tre-dagers kostholdsjournal som lar oss kvantifisere deres fruktoseforbruk blant annet. De vil deretter bli instruert i detalj hvordan de kan endre kostholdet for å eliminere fruktose og motta disse anbefalingene også skriftlig. På den første dagen av den syv dager lange diettintervensjonen vil de få tatt fastende blod og deretter måles fettinnholdet i leveren med MRS. Deretter vil de motta en pakke med glukose og utvalgt mat uten fruktose som supplement til kostholdet. I syv dager vil de deretter følge dietten uten fruktose og føre den detaljerte kostholdet. Den siste dagen av intervensjonen vil de få tatt fastende blod og HFC målt med MRS igjen (etter 168 timer nøyaktig).

   Emner: Femten forsøkspersoner i alderen 18 til 70 år vil bli inkludert i studien. På samme måte som i del A, er et slikt antall forsøkspersoner litt høyere enn 13 – et tall som er tilstrekkelig til å oppdage 10 ± 10 % reduksjon i HFC ved α = 0,05 (to-tailed paired t-test) og β = 0,10.

   For å bli inkludert må leverfettinnholdet i forsøkspersonene være høyere enn 6,2 % og mindre enn 16,5 % som tilsvarer steatose grad 2 (doi: 10.1007/s10334-011-0264-9). Deltakerne i del A av studien som oppfyller dette kriteriet kan også inkluderes i del B. Eksklusjonskriteriene vil være de samme som i del A. Før inntreden i studien vil forsøkspersonene signere de informerte samtykkene med deltakelse i studien og genetiske tester og før hvert forsøk vil de signere det informerte samtykket med MR-undersøkelse.

6. METODER MR-spektroskopi (MRS). Standard enkelt voxel spektroskopisekvens med pustholding (3 Tesla VIDA Siemens magnetisk resonans (MR) system utstyrt med flerkanals overflatekroppsspole) vil bli brukt til å måle leverfettinnhold (HFC). MR-bilder i tre anatomiske orienteringer vil bli brukt for å stille inn volumet av interesse på 40x30x25 mm. Korrigeringen av signalintensiteter til T2-relaksasjon vil bli gjort.

   For å få informasjon om lipidprofilen til levertriglyseridene (TG) vil MRS-spektrene bli analysert som beskrevet tidligere (doi: 10.3390/metabo11090625.).

   HISTO MR-avbildning (MRI). Proton Density Fat Fraction (PDFF)-avbildning vil bli målt ved hjelp av HISTO Siemens-protokollen godkjent av Food and Drug Administration (FDA). Den inkluderer spektroskopiske, Dixon- og multiekko-Dixon-sekvenser.

   Dataevaluering. MR-spektra vil bli evaluert ved å bruke LCModel (doi: 10.1002/nbm.698) og prosentandelen av HFC vurdert av MRS vil bli beregnet i henhold til Longo (doi: 10.1002/jmri.1880050311).

   Visceralt fettinnholdsmåling ved MR-avbildning. Innholdet av visceralt fett vil bli målt ved turbo spin ekkosekvens før eller etter PDFF måling. For å evaluere volumet av visceralt og subkutant fett vil programvare skrevet i MATLAB bli brukt. For å redusere påvirkningen fra operatøren, vil områder med visceralt fett bli evaluert av to uavhengige eksperter.

   Kroppssammensetning. Kroppssammensetningen under screeningen vil bli bestemt ved hjelp av InBody.

   Biokjemisk analyse. Blodet vil bli samlet i rør som inneholder alle nødvendige hemmere, umiddelbart plassert på isen og sentrifugert for å samle plasma innen 15 minutter. Glukose, triglyserid (TG), ikke-esterifiserte fettsyrer (NEFA), insulin og β-hydroksybutyrat vil bli målt i alle prøvene som ble tatt i studien. Alle nødvendige biokjemiske, radioimmunoassay (RIA) og enzym-koblede immunosorbent assay (ELISA) metoder for bestemmelse av disse parameterne er for tiden i bruk i søkernes laboratorier.

   Lipidomics. VLDL vil bli isolert ved ultrasentrifugering, og analysen av fettsyreprofilen til VLDL-triglyserider og plasmafrie fettsyrer vil bli utført ved væskekromatografi - massespektrometri (LC-MS) i Metabolomics-avdelingen ved Institute of Physiology, Czech Academy of Realfag (betalt tjeneste).

   Genetikk. Polymorfismer av gener (PNPLA, TM6SF2 og andre) som er kjent for å påvirke akkumulering av leverfett vil bli bestemt.

   Statistikk. Statistisk dataanalyse og korrelasjoner vil bli utført med PRISM 9.1 eller JMP-programvare.

7. TIDSPLAN FOR PROSJEKTET 2024: Del A: Utarbeidelse av studieprotokoller, søk og screening av emner, oppstart av studieeksamener i førsteemner - det skal gjennomføres ca 20 heldagseksamener av totalt 90 eksamener (3 eksamener pr. 30 fag). Antall emner som kan studeres er begrenset av tilgjengeligheten av MR-tomografi for forskningsstudier (1 dag i uken) og kompleksiteten til undersøkelser. Grunnleggende biokjemiske analyser vil bli utført kontinuerlig, men alle prøvene fra hvert individ (30 totalt) vil bli lagret ved -80°C og analysert samtidig.

Del B: Utarbeidelse av studieprotokoller og kostholdsjournaler som kan brukes til kvantifisering av fruktoseforbruk. Søk og screening av fag.

2025: Del A: Siling av fag, studieeksamener - min. Det skal gjennomføres 30 heldagsundersøkelser. Videreføring av biokjemiske analyser.

Del B: Screening av forsøkspersoner (emner med hepatosteatose studert i del A kan også inkluderes i del B). Diettintervensjonsforsøk (ca. n=20) på ca. 10 forsøkspersoner (1 forsøksperson i uken kan interveneres, inkludert MR-undersøkelse og isolering av VLDL over natten på første og siste intervensjonsdag). Biokjemiske analyser.

2026: Del A: Siling av fag, studieeksamener - min. Det skal gjennomføres 30 heldagsundersøkelser. Videreføring av biokjemiske analyser. Start av intensiv dataanalyse.

Del B: Screening av fag. Diettintervensjonseksperimenter (n = 10) i gjenværende forsøkspersoner på første og siste intervensjonsdag. Biokjemiske analyser. Spesialiserte biokjemiske analyser (for eksempel ELISA for fibroblast rowth factor 19 (FGF-19), utvalgte hepatokiner eller andre proteiner som kan være involvert i regulering av de novo lipogenese) og lipidomanalyse av fettsyreprofil i fri fettsyre (FFA) pool og TG i VLDL. Analyse av data og publisering av resultater.

2027: Del A: Studieeksamen i gjenstående emner - maks. Det vil bli gjennomført 10 heldagsundersøkelser. Videreføring av rutinemessige biokjemiske analyser. Spesialiserte biokjemiske analyser (se ovenfor). Analyse av data og publisering av resultater.

Del B: Endelig analyse av dataene og publisering av resultater.

8. FORVENTEDE RESULTATER Dette prosjektet vil gi ny innsikt i mekanismene som enkle karbohydrater påvirker akkumulering av leverfett. Av spesiell betydning vil det være å sammenligne rollen til fruktose og glukose (som er intensivt studert, men ikke brukt av befolkningen) og rollen til sukrose, sukkeret som vanligvis brukes til å søte av hele befolkningen. Dessuten bør eksperimentet med fruktoserestriksjon fra dietten avgjøre om en slik intervensjon kan være nyttig for behandling av hepatosteatose. I det hele tatt bør begge deler av prosjektene gi resultater som kan implementeres i praktiske kostholdsanbefalinger og forbedre strategiene for håndtering av NAFLD.