Роль сахаров в накоплении жира в печени (FROGLOSA)

1. ВВЕДЕНИЕ Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) в настоящее время является основной причиной хронических заболеваний печени, ею страдает примерно четверть населения планеты, и заболеваемость этим заболеванием продолжает расти (doi: 10.1210/endrev/bnz009). Возникновение НАЖБП тесно связано с ожирением, резистентностью к инсулину и/или диабетом 2 типа (doi: 10,7759/cureus.20776). Некоторые авторы даже считают НАЖБП печеночным проявлением метаболического синдрома или даже предшественником развития метаболического синдрома (doi: 10.1016/j.dld.2014.09.020).

   Рост заболеваемости НАЖБП объясняется малоподвижным образом жизни, потреблением энергии, неадекватным затратам энергии, а также повышенным потреблением простых углеводов (добавленных сахаров) и, в частности, повышенным потреблением фруктозы (как части молекулы сахарозы, так и , особенно в США (США), в качестве компонента кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы (HFCS)). За последние десятилетия был представлен ряд работ, показавших связь между повышенным потреблением добавленных сахаров (особенно фруктозы) и пандемией ожирения и резистентности к инсулину (doi: 10.1097/MOL.0b013e3283613bca, doi: 10.1007/s00394-018-1711-4, doi: 10.1016/j.nut.2013.08.014).

   Однако недавние метаанализы не подтвердили роль повышенного потребления добавленного сахара или фруктозы в развитии ожирения, резистентности к инсулину, метаболического синдрома и диабета 2 типа. ). Они скорее предполагают, что добавленные сахара вредны, если связаны с недостаточно повышенным потреблением энергии. Было даже высказано предположение, что повышенное потребление фруктозы/добавленного сахара может быть маркером нездорового образа жизни. С другой стороны, имеется не так много данных о роли добавленных сахаров и, в частности, фруктозы, в развитии ожирения печени.

   Это может быть связано с тем, что метаболизм глюкозы и обмен фруктозы в печени принципиально различны (doi: 10.1016/j.jada.2010.06.008, doi: 10.3390/nu9091026, doi: 10.1016/j.clnu.2020.12. 022). В отличие от глюкозы, которая в основном метаболизируется во внепеченочных тканях, большая часть фруктозы усваивается и метаболизируется непосредственно в печени. Более того, фосфорилирование фруктозы во фруктозо-1-фосфат, катализируемое фруктокиназой/кетогексокиназой, не находится под контролем обратной связи и приводит к неконтролируемому образованию триозо-3-фосфатов. Они могут вступать в путь глюконеогенеза и в дальнейшем использоваться для пополнения запасов гликогена (в состоянии истощения гликогена), но они также могут служить субстратом для липогенеза de novo (DNL) и в то же время ингибировать окисление жирных кислот. Фруктоза, по-видимому, также является мощным активатором регуляторного пути белка, связывающего регуляторные элементы углевода (ChREBP), который вместе с белком, связывающим регуляторные элементы стерола (SREBP), способствует развитию DNL в печени.

   Важно отметить, что, несмотря на то, что жирные кислоты, высвобождаемые из жировой ткани, являются основным источником жира в печени, вклад ДНЛ в накопление жира в печени значительно увеличивается именно у пациентов с НАЖБП (doi: 10,1172/JCI23621, doi: 10,1053/j). .гастро.2013.11.049).

   Исследования, изучающие влияние потребления фруктозы на содержание жира в печени (HFC), не привели к однозначным выводам. У здоровых людей введение фруктозы в изокалорических условиях, по-видимому, не оказывает никакого влияния на ГФУ (doi: 10.1093/ajcn/84.6.1374, doi: 10.1093/ajcn/nqz271). Жир накапливался в печени здоровых людей только при соблюдении гиперкалорийной диеты с высоким содержанием фруктозы (doi: 10.3945/ajcn.2008.27336). Напротив, мужчины с абдоминальным ожирением накапливали больше жира в печени даже на изокалорийной диете с высоким содержанием фруктозы (doi: 10.1111/joim.12632). Интересно, что в исследовании, сравнивающем диету с высоким содержанием глюкозы и фруктозы как в изо-, так и в гиперкалорийных условиях, мужчины с избыточным весом накапливали жир в печени только в условиях гиперкалорийности, но не было обнаружено никакой разницы в влиянии на HFC между глюкозой и фруктозой ( doi: 10.1053/j.gastro.2013.07.012).

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ Глюкоза и фруктоза могут оказывать различное влияние на накопление жира в печени, что мы продемонстрировали в наших исследованиях острых изменений HFC после введения питательных веществ (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05). ). В этих исследованиях мы разработали и внедрили функциональный тест, который позволил нам отслеживать острые изменения содержания жира в печени после нагрузки с высоким содержанием жиров и/или простых углеводов. В тесте 150 г жира вводят испытуемым в начале эксперимента, тогда как углеводы (50 г фруктозы или глюкозы) вводят каждые 2 часа для эффективного подавления липолиза в жировой ткани, что документально подтверждено подавлением неэтерифицированной жировой ткани. концентрация жирных кислот (NEFA) (doi: 10,1093/ajcn/nqy386). Таким образом, мы можем ограничить влияние жирных кислот из жировой ткани на накопление жира в печени, а полученные изменения следует объяснить вкладом диетического жира или DNL.

   Важно отметить, что в этой модели мы показали, что через 6 часов после употребления 150 г жира (сливок) HFC увеличивается как у здоровых людей, не страдающих ожирением, с нормальным содержанием жира (doi: 10.1093/ajcn/nqy386), так и у людей, не страдающих ожирением. субъекты с гепатостеатозом (doi: 10.26402/jpp.2021.1.05). Жир в печени увеличивается также при одновременном приеме фруктозы с жиром. Напротив, одновременный прием глюкозы с жиром предотвращает такое увеличение ГФУ (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05).

3. ОБОСНОВАНИЕ ПРОЕКТА Добавленные сахара составляют более 12% ежедневного потребления энергии. Их роль в накоплении жира в печени до сих пор изучалась с использованием чистой глюкозы или чистой фруктозы. Однако в реальной жизни люди не потребляют чистую глюкозу или фруктозу, они потребляют фруктозу вместе с глюкозой либо в составе сахарозы, либо в составе кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы. Не совсем ясно, как содержание жира в печени отреагирует на смесь обоих сахаров. Вопрос о том, как одновременное употребление обеих гексоз влияет на накопление жира в печени, может иметь большое практическое значение, и ответ на этот вопрос может в значительной степени способствовать модификации диетических рекомендаций для лечения НАЖБП.

   Важно отметить, что нам не удалось продемонстрировать разницу между реакцией HFC на введение глюкозы и фруктозы у субъектов, не страдающих ожирением и не страдающих диабетом (doi: 10.26402/jpp.2021.1.05), было бы предпочтительнее изучить острое воздействие этих трех сахаров на ГФУ после их одновременного применения с высоким содержанием жиров.

   Ряд исследований четко задокументировал неблагоприятное воздействие чрезмерного потребления фруктозы на метаболическое здоровье. С другой стороны, если фруктоза вредит здоровью человека, было бы важно знать, влияет ли ограничение фруктозы на ГФУ. Действительно, ограничение фруктозы привело к значительному уменьшению количества жира в печени через 9 дней у детей с ожирением (doi: 10.1053/j.gastro.2017.05.043) и через 6 недель у людей с ожирением (doi: 10.1093/ajcn/nqaa332). Основываясь на наших предыдущих результатах, можно предположить, что исключение фруктозы из рациона и замена ее крахмалом или глюкозой должны эффективно подавлять содержание жира в печени даже за несколько дней.

4. ГИПОТЕЗЫ

   Будут проверены две основные гипотезы:

   • Увеличение содержания жира в печени после высокой жировой нагрузки компенсируется глюкозой, но не фруктозой или сахарозой (Часть А проекта).
   • Кратковременное (7 дней) диетическое ограничение фруктозы приводит к снижению содержания жира в печени (Часть Б проекта).

5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ДИЗАЙН Часть А. Дизайн этой части исследования будет таким же, как и в наших предыдущих исследованиях (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05). за исключением того, что во время каждого эксперимента будут проводиться только два измерения содержания жира в печени (HFC) с помощью магнитно-резонансной спектроскопии (MRS). По каждому предмету исследования будут проведены три экзамена продолжительностью около 8 часов. Сначала содержание жира в печени (HFC) будет измеряться с помощью MRS (30-45 минут). Затем канюлю введут в локтевую вену и сделают первый забор крови. Затем субъекты получат 460 мл сливок (высокая жировая нагрузка - всего 150 г жира) с фруктовым чаем, подслащенным 50 г одного из сахаров (глюкозы/фруктозы/сахарозы). Через два и четыре часа они снова получат фруктовый чай, подслащенный тем же сахаром, что и в момент времени 0 ч. Кровь на биохимический анализ потом берут на 0,5, 1, 2 (до чая), 2,5, 3, 4 (до чая), 4,5, 5 и 6 часах. В течение дня субъекты не будут получать никакой еды, им будет разрешено пить только воду или фруктовый чай. Измерение содержания жира в печени повторяют через 6 часов. Во время магнитно-резонансного (МР) исследования также будет измерен объем висцерального жира и определен состав тела. Порядок обследований будет рандомизированным, и они будут проводиться с интервалом не менее двух недель.

   Субъекты: В этой части проекта будут изучены две группы добровольцев мужского пола - 15 субъектов, не страдающих ожирением (индекс массы тела (ИМТ) <30 кг/м2) и 15 субъектов, страдающих ожирением (ИМТ ˃ 30 кг/м2). Возраст участников будет от 18 до 70 лет, группы будут подобраны по возрасту. Основываясь на наших предыдущих исследованиях со здоровыми мужчинами, количество 13 человек в одной группе должно быть достаточным для обнаружения увеличения HFC на 10 ± 10% после жировой нагрузки при α = 0,05 (двусторонний парный t-критерий) и β = 0,10. . Несколько большее число на группу покрывает риски, связанные с исключением или прекращением участия некоторых субъектов во время исследования.

   Критериями исключения для обеих групп будут сахарный диабет (глюкоза натощак выше 7 ммоль/л, глюкоза через 2 часа после оГТТ ˃ 11,1 ммоль/л или противодиабетическое лечение) или другие тяжелые заболевания (сердечно-сосудистые заболевания, рак и т. д.), алкоголь. потребление ˃ 30 г/день, непереносимость фруктозы, прием препаратов, влияющих на липидный обмен и непереносимость МР-исследований (клаустрофобия, металлообследование). имплантаты и др.). Перед входом в исследование субъекты подписывают информированное согласие на участие в исследовании и генетических тестах, а перед каждым экспериментом они подписывают информированное согласие на проведение МР-исследования.

   Часть B. Субъекты, отобранные для этой части исследования, сначала заполнят подробный трехдневный дневник питания, что позволит нам, среди прочего, количественно оценить потребление ими фруктозы. Затем они будут подробно проинструктированы, как изменить свой рацион, чтобы исключить фруктозу, и получат эти рекомендации также в письменном виде. В первый день семидневного диетического вмешательства у них натощак возьмут кровь, а затем определят содержание жира в печени с помощью MRS. После этого они получат упаковку глюкозы и избранные продукты без фруктозы для дополнения своего рациона. Затем в течение семи дней они будут соблюдать диету без фруктозы и вести подробный учет рациона. В последний день вмешательства у них возьмут кровь натощак и снова измерят HFC с помощью MRS (ровно через 168 часов).

   Субъекты: В исследование будут включены пятнадцать субъектов в возрасте от 18 до 70 лет. Как и в Части А, такое количество субъектов немного превышает 13 – количество, достаточное для обнаружения снижения HFC на 10 ± 10% при α = 0,05 (двусторонний парный t-критерий) и β = 0,10.

   Для включения содержание жира в печени у субъектов должно быть выше 6,2% и менее 16,5%, что соответствует стеатозу 2 степени (doi: 10.1007/s10334-011-0264-9). Участники Части А исследования, соответствующие этому критерию, также могут быть включены в Часть Б. Критерии исключения будут такими же, как и в Части А. Перед включением в исследование субъекты подпишут информированное согласие на участие в исследовании и генетические тесты и перед каждым экспериментом подписывают информированное согласие на проведение МРТ-обследования.

6. МЕТОДЫ МР-спектроскопии (МРС). Для измерения содержания жира в печени (HFC) будет использоваться стандартная последовательность одновоксельной спектроскопии с задержкой дыхания (система магнитного резонанса (MR) 3 Tesla VIDA Siemens, оснащенная многоканальной поверхностной катушкой тела). МРТ-изображения в трех анатомических ориентациях будут использоваться для установления интересующего объема 40х30х25 мм. Будет произведена коррекция интенсивности сигнала с учетом релаксации Т2.

   Чтобы получить информацию о липидном профиле триглицеридов печени (ТГ), спектры MRS будут проанализированы, как описано ранее (doi: 10.3390/metabo11090625.).

   ГИСТО-МР томография (МРТ). Визуализация фракции протонной плотности жира (PDFF) будет измеряться по протоколу HISTO Siemens, одобренному Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA). Он включает спектроскопические последовательности, последовательности Диксона и мультиэхо-последовательности Диксона.

   Оценка данных. Спектры МР будут оцениваться с использованием LCModel (doi: 10.1002/nbm.698). а процент ГФУ, оцененный MRS, будет рассчитываться по Лонго (doi: 10.1002/jmri.1880050311).

   Измерение содержания висцерального жира с помощью МРТ. Содержание висцерального жира будет измеряться с помощью последовательности турбоспин-эхо до или после измерения PDFF. Для оценки объема висцерального и подкожного жира будет использоваться программное обеспечение, написанное на MATLAB. Чтобы снизить воздействие оператора, участки висцерального жира будут оцениваться двумя независимыми экспертами.

   Состав тела. Состав тела во время скрининга будет определяться с помощью InBody.

   Биохимический анализ. Кровь будет собрана в пробирки, содержащие все необходимые ингибиторы, немедленно помещена на лед и центрифугирована для сбора плазмы в течение 15 минут. Глюкоза, триглицерид (ТГ), неэтерифицированные жирные кислоты (НЭЖК), инсулин и β-гидроксибутират будут измеряться во всех образцах, полученных в исследовании. В настоящее время в лабораториях заявителей используются все необходимые биохимические, радиоиммуноанализы (РИА) и иммуноферментный анализ (ИФА) для определения этих показателей.

   Липидомика. ЛПОНП будут выделены ультрацентрифугированием, а анализ жирнокислотного профиля триглицеридов ЛПОНП и свободных жирных кислот плазмы будет проведен с помощью жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии (ЖХ-МС) в отделе метаболомики Института физиологии Чешской академии медицины. наук (платная услуга).

   Генетика. Будут определены полиморфизмы генов (PNPLA, TM6SF2 и др.), которые, как известно, влияют на накопление жира в печени.

   Статистика. Статистический анализ данных и корреляция будут выполняться с помощью программного обеспечения PRISM 9.1 или JMP.

7. ВРЕМЕННОЙ РАСПИСАНИЕ ПРОЕКТА 2024: Часть A: Подготовка протоколов обучения, поиск и отбор предметов, начало учебных экзаменов по первым предметам - будет проведено около 20 экзаменов на целый день из 90 экзаменов (по 3 экзамена на каждый из 30 предметов). Количество предметов, которые можно изучать, ограничено наличием МР-томографа для научных исследований (1 день в неделю) и сложностью обследований. Основные биохимические анализы будут проводиться непрерывно, но все образцы от каждого субъекта (всего 30) будут храниться при -80°C и анализироваться одновременно.

Часть B: Подготовка протоколов исследований и записей о питании, которые можно использовать для количественной оценки потребления фруктозы. Поиск и отбор предметов.

2025: Часть A: Отбор предметов, учебные экзамены - мин. Будет проведено 30 целодневных обследований. Продолжение биохимических анализов.

Часть B: Скрининг субъектов (субъекты с гепатостеатозом, изученные в Части A, также могут быть включены в Часть B). Эксперименты по диетическому вмешательству (ок. n=20) примерно через 10 субъектов (можно вмешаться по одному субъекту в неделю, включая МР-обследование и ночную изоляцию ЛПОНП в первый и последний день вмешательства). Биохимические анализы.

2026: Часть A: Отбор предметов, учебные экзамены – мин. Будет проведено 30 целодневных обследований. Продолжение биохимических анализов. Начало интенсивного анализа данных.

Часть B: Скрининг субъектов. Эксперименты по диетическому вмешательству (n = 10) у остальных субъектов в первый и последний день вмешательства. Биохимические анализы. Специализированные биохимические анализы (например, ELISA для фактора роста фибробластов 19 (FGF-19), выбранных гепатокинов или других белков, которые могут участвовать в регуляции липогенеза de novo) и липидомный анализ профиля жирных кислот в пуле свободных жирных кислот (СЖК). и ТГ в ЛПОНП. Анализ данных и публикация результатов.

2027: Часть A: Учебные экзамены по остальным предметам – макс. Будет проведено 10 полнодневных обследований. Продолжение рутинных биохимических анализов. Специализированные биохимические анализы (см. выше). Анализ данных и публикация результатов.

Часть B: Окончательный анализ данных и публикация результатов.

8. ОЖИДАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ Этот проект позволит по-новому взглянуть на механизмы, с помощью которых простые углеводы влияют на накопление жира в печени. Особое значение будет иметь сравнение роли фруктозы и глюкозы (которые интенсивно изучаются, но не используются населением) и сахарозы, сахара, обычно используемого для подслащивания всем населением. Более того, эксперимент с ограничением фруктозы в рационе должен определить, может ли такое вмешательство быть полезным для лечения гепатостеатоза. В целом обе части проекта должны дать результаты, которые можно будет реализовать в практических диетических рекомендациях и улучшить стратегии ведения НАЖБП.