Role cukrů v akumulaci tuku v játrech (FROGLOSA)

1. ÚVOD Nealkoholické ztukovatění jater (NAFLD) je v současnosti hlavní příčinou chronického onemocnění jater, postihuje přibližně jednu čtvrtinu celosvětové populace a výskyt onemocnění stále stoupá (doi: 10.1210/endrev/bnz009). Výskyt NAFLD je úzce spojen s obezitou, inzulinovou rezistencí a/nebo diabetem 2. typu (doi: 10.7759/cureus.20776). Někteří autoři dokonce považují NAFLD za jaterní projev metabolického syndromu nebo dokonce za prekurzor rozvoje metabolického syndromu (doi: 10.1016/j.dld.2014.09.020).

   Rostoucí výskyt NAFLD je připisován sedavému životnímu stylu, příjmu energie neadekvátnímu výdeji energie a také zvýšenému příjmu jednoduchých sacharidů (přidané cukry) a konkrétně zvýšenému příjmu fruktózy (jak jako součást molekuly sacharózy, tak i , zejména ve Spojených státech (USA), jako součást kukuřičného sirupu s vysokým obsahem fruktózy (HFCS)). V posledních desetiletích byla předložena řada prací, které prokázaly souvislost mezi zvýšenou konzumací přidaných cukrů (zejména fruktózy) a pandemií obezity a inzulínové rezistence (doi: 10.1097/MOL.0b013e3283613bca, doi: 10.1007/s00394-018-1711-4, doi: 10.1016/j.nut.2013.08.014).

   Nedávné metaanalýzy však nepodpořily roli zvýšeného příjmu přidaného cukru nebo fruktózy při rozvoji obezity, inzulínové rezistence, metabolického syndromu a diabetu 2. typu (doi: 10.1017/S0954422414000067, doi: 10.1007/s00394-016-134 ). Spíše naznačují, že přidané cukry jsou škodlivé, pokud jsou spojeny s neadekvátně zvýšeným příjmem energie. Bylo dokonce navrženo, že zvýšená konzumace fruktózy/přidaných cukrů může být známkou nezdravého životního stylu. Na druhou stranu není k dispozici tolik údajů o úloze přidaných cukrů a konkrétně fruktózy při vzniku ztučnění jater.

   To může být způsobeno tím, že metabolismus glukózy a fruktózy v játrech je zásadně odlišný (doi: 10.1016/j.jada.2010.06.008, doi: 10.3390/nu9091026, doi: 10.1016/j.clnu.2020 022). Na rozdíl od glukózy, která je z velké části metabolizována extrahepatálními tkáněmi, je většina fruktózy přímo vychytávána a metabolizována játry. Navíc fosforylace fruktózy na fruktóza-1-fosfát katalyzovaná fruktokinázou/ketohexokinázou není pod zpětnou kontrolou a vede k nekontrolované produkci trioso-3-fosfátů. Ty mohou vstoupit do dráhy glukoneogeneze a být dále využity k doplnění glykogenu (ve stavu vyčerpání glykogenu), ale mohou také poskytnout substrát pro de novo lipogenezi (DNL) a současně inhibovat oxidaci mastných kyselin. Fruktóza se zdá být také účinným aktivátorem regulační dráhy proteinu vázajícího na sacharidy (ChREBP), která spolu s proteinem vázajícím regulační element sterolu (SREBP) podporuje DNL v játrech.

   Důležité je, že navzdory skutečnosti, že mastné kyseliny uvolňované z tukové tkáně jsou hlavním zdrojem tuku v játrech, příspěvek DNL k akumulaci tuku v játrech výrazně stoupá specificky u pacientů s NAFLD (doi: 10.1172/JCI23621, doi: 10.1053/j .gastro.11.049 2013).

   Studie sledující vliv konzumace fruktózy na obsah tuku v játrech (HFC) nedospěly k jednoznačnému závěru. U zdravých subjektů se nezdá, že by podávání fruktózy za izokalorických podmínek mělo žádný vliv na HFC (doi: 10.1093/ajcn/84.6.1374, doi: 10.1093/ajcn/nqz271). Tuk se hromadil v játrech zdravých jedinců pouze při vystavení hyperkalorické dietě s vysokým obsahem fruktózy (doi: 10.3945/ajcn.2008.27336). Naopak muži s břišní obezitou akumulovali více tuku v játrech i při izokalorické dietě s vysokým obsahem fruktózy (doi: 10.1111/joim.12632). Je zajímavé, že ve studii srovnávající dietu s vysokým obsahem glukózy a s vysokým obsahem fruktózy za izo- a hyperkalorických podmínek muži s nadváhou hromadili jaterní tuk v játrech pouze za hyperkalorických podmínek, ale nebyl zjištěn žádný rozdíl v účinku na HFC mezi glukózou a fruktózou ( doi: 10.1053/j.gastro.2013.07.012).

2. PILOTNÍ ÚDAJE Glukóza a fruktóza mohou mít různé účinky na akumulaci tuku v játrech, což jsme prokázali v našich studiích akutních změn HFC po podání živin (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05 ). V těchto studiích jsme vyvinuli a zavedli funkční test, který nám umožnil sledovat akutní změny jaterního tuku po zátěži s vysokým obsahem tuků a/nebo jednoduchých sacharidů. V testu je 150 g tuku podáváno subjektům na začátku experimentu, zatímco sacharidy (50 g fruktózy nebo glukózy) jsou podávány každé 2 hodiny k účinnému potlačení lipolýzy v tukové tkáni, jak je dokumentováno potlačením neesterifikované koncentrace mastných kyselin (NEFA) (doi: 10.1093/ajcn/nqy386). Tímto způsobem můžeme omezit vliv mastných kyselin z tukové tkáně na akumulaci jaterního tuku a výsledné změny by měly být vysvětleny přispěním tuku v potravě nebo DNL.

   Důležité je, že v tomto modelu jsme ukázali, že 6 hodin po konzumaci 150 g tuku (smetany) se HFC zvyšuje jak u zdravých neobézních subjektů s normálním obsahem tuku (doi: 10.1093/ajcn/nqy386), tak i u neobézních. subjekty s hepatosteatózou (doi: 10.26402/jpp.2021.1.05). Tuk v játrech se zvyšuje také při současném podávání fruktózy s tukem. Naopak současné podávání glukózy s tukem takovému zvýšení HFC brání (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05).

3. ODŮVODNĚNÍ PROJEKTU Přidané cukry představují více než 12 % denního energetického příjmu. Jejich role při akumulaci jaterního tuku byla dosud studována s čistou glukózou nebo čistou fruktózou. V reálném životě však lidé nekonzumují čistou glukózu ani fruktózu, fruktózu konzumují společně s glukózou jak jako součást sacharózy, tak ve vysokofruktózovém kukuřičném sirupu. Není zcela jasné, jak bude obsah tuku v játrech reagovat na směs obou cukrů. Otázka, jak současná konzumace obou hexóz ovlivňuje hromadění tuku v játrech, může mít velký praktický význam a zodpovězení této otázky může výrazně přispět k úpravě dietních doporučení pro léčbu NAFLD.

   Důležité je, že jsme nebyli schopni prokázat rozdíl mezi odpovědí HFC na podání glukózy a fruktózy u neobézních nediabetických subjektů (doi: 10.26402/jpp.2021.1.05), bylo by vhodnější studovat akutní účinky těchto tří cukrů na HFC po jejich společném podávání s vysokým obsahem tuku.

   Řada studií jasně prokázala nepříznivé účinky nadměrné konzumace fruktózy na metabolické zdraví. Na druhou stranu, pokud fruktóza poškozuje lidské zdraví, bylo by důležité vědět, zda omezení fruktózy má vliv na HFC. Omezení fruktózy skutečně vedlo k významnému snížení jaterního tuku po 9 dnech u obézních dětí (doi: 10.1053/j.gastro.2017.05.043) a po 6 týdnech u obézních jedinců (doi: 10.1093/ajcn/nqaa332). Na základě našich předchozích výsledků lze předpokládat, že vyřazení fruktózy ze stravy a její nahrazení škrobem nebo glukózou by mělo účinně potlačit obsah tuku v játrech již za několik dní.

4. HYPOTÉZY

   Budou testovány dvě základní hypotézy:

   • Nárůst obsahu tuku v játrech po vysoké tukové zátěži je tlumen glukózou, ale ne fruktózou ani sacharózou (část A projektu).
   • Krátkodobá (7 dní) dietní restrikce fruktózy vede ke snížení obsahu tuku v játrech (část B projektu)

5. EXPERIMENTÁLNÍ NÁVRH Část A Návrh této části studie bude stejný jako v našich předchozích studiích (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05) kromě toho, že během každého experimentu budou provedena pouze dvě měření obsahu tuku v játrech (HFC) magnetickou rezonanční spektroskopií (MRS). U každého předmětu studie budou provedeny tři zkoušky v délce přibližně 8 hodin. Nejprve bude měřen obsah tuku v játrech (HFC) pomocí MRS (30-45 minut). Kanyla se poté zavede do předloktní žíly a provede se první odběr krve. Subjekty pak dostanou 460 ml smetany (vysoká tuková zátěž - celkem 150 g tuku) s ovocným čajem slazeným 50 g jednoho z cukrů (glukóza/fruktóza/sacharóza). O dvě a čtyři hodiny později dostanou opět ovocný čaj slazený stejným cukrem jako v čase 0 hodin. Krev pro biochemické analýzy bude poté odebrána v 0,5, 1, 2 (před čajem), 2,5, 3, 4 (před čajem), 4,5, 5 a 6 hodinách. Během dne nebudou subjekty dostávat žádné jídlo a bude jim povoleno pít pouze vodu nebo ovocný čaj. Měření obsahu tuku v játrech bude opakováno v čase 6 hodin. Při vyšetření magnetickou rezonancí (MR) bude také změřen objem viscerálního tuku a bude stanoveno složení těla. Pořadí vyšetření bude náhodné a bude prováděno v minimálně dvoutýdenních intervalech.

   Subjekty: V této části projektu budou studovány dvě skupiny mužských dobrovolníků – 15 neobézních subjektů (Body Mass Index (BMI) < 30 kg/m2) a 15 obézních subjektů (BMI ˃ 30 kg/m2). Účastníci budou ve věku 18 - 70 let a skupiny budou věkově shodné. Na základě našich předchozích studií se zdravými mužskými subjekty by počet 13 subjektů v jedné skupině měl být dostatečný k detekci 10 ± 10% přírůstku HFC po tukové zátěži při α = 0,05 (dvoustranný párový t-test) a β = 0,10 . Mírně vyšší počet na skupinu pokrývá rizika spojená s vyloučením nebo stažením některých subjektů během studie.

   Vylučovacím kritériem pro obě skupiny bude diabetes mellitus (glykémie nalačno nad 7 mmol/l, glykémie 2 hodiny po oGTT ˃ 11,1 mmol/l nebo antidiabetická léčba) nebo jiná závažná onemocnění (kardiovaskulární onemocnění, rakovina atd.), alkohol spotřeba ˃ 30 g/den, intolerance fruktózy, užívání léků ovlivňujících metabolismus lipidů a intolerance MR vyšetření (klaustrofobie, kovové implantáty aj.). Subjekty před vstupem do studie podepíší informovaný souhlas s účastí ve studii a genetických testech a před každým experimentem podepíší informovaný souhlas s MR vyšetřením.

   Část B Subjekty vybrané pro tuto část studie nejprve vyplní podrobný třídenní dietní záznam, který nám mimo jiné umožní kvantifikovat jejich spotřebu fruktózy. Poté budou podrobně instruováni, jak změnit svůj jídelníček tak, aby se vyloučila fruktóza a tato doporučení obdrží i písemně. První den sedmidenní dietní intervence jim bude nalačno odebrána krev a poté bude pomocí MRS změřen obsah tuku v játrech. Poté dostanou balíček glukózy a vybrané potraviny bez fruktózy pro doplnění stravy. Sedm dní pak budou dodržovat dietu bez fruktózy a vést si podrobný jídelníček. Poslední den intervence jim bude nalačno odebrána krev a znovu změřen HFC pomocí MRS (přesně po 168 hodinách).

   Subjekty: Do studie bude zahrnuto 15 subjektů ve věku 18 až 70 let. Podobně jako v části A je takový počet subjektů mírně vyšší než 13 - počet dostatečný k detekci 10 ± 10% poklesu HFC při α = 0,05 (dvoustranný párový t-test) a β = 0,10.

   Aby byl zahrnut, obsah tuku v játrech u subjektů musí být vyšší než 6,2 % a nižší než 16,5 %, což odpovídá steatóze stupně 2 (doi: 10.1007/s10334-011-0264-9). Účastníci části A studie splňující toto kritérium mohou být zařazeni i do části B. Kritéria vyloučení budou stejná jako v části A. Subjekty před vstupem do studie podepíší informovaný souhlas s účastí ve studii a genetické testy a před každým experimentem podepíší informovaný souhlas s MR vyšetřením.

6. METODY MR spektroskopie (MRS). K měření obsahu tuku v játrech (HFC) bude použita standardní sekvence jednovoxelové spektroskopie se zadržením dechu (3 Tesla VIDA Siemens systém magnetické rezonance (MR) vybavený vícekanálovou povrchovou tělesnou cívkou). MR snímky ve třech anatomických orientacích poslouží k nastavení zájmového objemu 40x30x25 mm. Bude provedena korekce intenzit signálů na relaxaci T2.

   Pro získání informací o lipidovém profilu jaterních triglyceridů (TG) budou MRS spektra analyzována, jak bylo popsáno dříve (doi: 10.3390/metabo11090625.).

   HISTO MR zobrazování (MRI). Zobrazování frakce tuku s protonovou hustotou (PDFF) bude měřeno protokolem HISTO Siemens schváleným Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv (FDA). Zahrnuje spektroskopické, Dixonovy a multiecho Dixonovy sekvence.

   Vyhodnocení dat. MR spektra budou vyhodnocena pomocí LCModel (doi: 10.1002/nbm.698) a procento HFC hodnocené MRS bude vypočteno podle Longa (doi: 10.1002/jmri.1880050311).

   Měření obsahu viscerálního tuku pomocí MR zobrazení. Obsah viscerálního tuku bude měřen pomocí turbo spin echo sekvence před nebo po měření PDFF. K vyhodnocení objemu viscerálního a podkožního tuku bude použit software napsaný v MATLABu. Aby se snížil dopad operátora, budou oblasti viscerálního tuku hodnoceny dvěma nezávislými odborníky.

   Složení těla. Složení těla během screeningu bude určeno pomocí InBody.

   Biochemická analýza. Krev bude odebrána do zkumavek obsahujících všechny potřebné inhibitory, okamžitě umístěna na led a odstředěna, aby se shromáždila plazma do 15 minut. Glukóza, triglyceridy (TG), neesterifikované mastné kyseliny (NEFA), inzulín a β-hydroxybutyrát budou měřeny ve všech vzorcích získaných ve studii. V laboratořích žadatelů se v současné době používají všechny potřebné biochemické metody, radioimunoanalýza (RIA) a ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) pro stanovení těchto parametrů.

   Lipidomika. VLDL bude izolován ultracentrifugací a analýza profilu mastných kyselin VLDL-triglyceridů a volných mastných kyselin v plazmě bude provedena kapalinovou chromatografií - hmotnostní spektrometrií (LC-MS) v oddělení metabolismu Fyziologického ústavu AV ČR. Vědy (placená služba).

   Genetika. Budou stanoveny polymorfismy genů (PNPLA, TM6SF2 a další), o kterých je známo, že ovlivňují akumulaci jaterního tuku.

   Statistika. Statistická analýza dat a korelace budou provedeny pomocí softwaru PRISM 9.1 nebo JMP.

7. ČASOVÝ HARMONOGRAM PROJEKTU 2024: Část A: Příprava studijních protokolů, vyhledávání a screening předmětů, zahájení zkoušek z prvních předmětů - bude provedeno cca 20 celodenních zkoušek z celkového počtu 90 zkoušek (3 zkoušky na každou 30 předmětů). Počet předmětů, které lze studovat, je omezen dostupností MR tomografu pro výzkumné studie (1 den v týdnu) a náročností vyšetření. Základní biochemické analýzy budou prováděny kontinuálně, ale všechny vzorky od každého subjektu (celkem 30) budou skladovány při -80°C a analyzovány současně.

Část B: Příprava studijních protokolů a dietních záznamů, které lze použít pro kvantifikaci spotřeby fruktózy. Vyhledávání a prověřování předmětů.

2025: Část A: Screening předmětů, studijní zkoušky - min. Bude provedeno 30 celodenních vyšetření. Pokračování biochemických rozborů.

Část B: Screening subjektů (subjekty s hepatosteatózou studované v části A lze také zařadit do části B). Dietní intervenční experimenty (cca. n=20) v cca. 10 subjektů (lze intervenovat 1 subjekt týdně, včetně MR vyšetření a noční izolace VLDL první a poslední den intervence). Biochemické analýzy.

2026: Část A: Screening předmětů, studijní zkoušky - min. Bude provedeno 30 celodenních vyšetření. Pokračování biochemických rozborů. Zahájení intenzivní analýzy dat.

Část B: Prověřování předmětů. Experimenty dietní intervence (n = 10) u zbývajících subjektů první a poslední den intervence. Biochemické analýzy. Specializované biochemické analýzy (například ELISA pro fibroblastový řádkový faktor 19 (FGF-19), vybrané hepatokiny nebo jiné proteiny, které se mohou podílet na regulaci de novo lipogeneze) a lipidomická analýza profilu mastných kyselin v poolu volných mastných kyselin (FFA) a TG ve VLDL. Analýza dat a publikování výsledků.

2027: Část A: Studijní zkoušky ze zbývajících předmětů - max. Bude provedeno 10 celodenních vyšetření. Pokračování v rutinních biochemických rozborech. Specializované biochemické analýzy (viz výše). Analýza dat a publikování výsledků.

Část B: Konečná analýza dat a zveřejnění výsledků.

8. OČEKÁVANÉ VÝSLEDKY Tento projekt poskytne nové poznatky o mechanismech, kterými jednoduché sacharidy ovlivňují hromadění jaterního tuku. Zvláštní význam bude mít srovnání role fruktózy a glukózy (které jsou intenzivně studovány, ale nejsou populací využívány) a sacharózy, cukru obecně používaného ke slazení celou populací. Navíc experiment s omezením fruktózy ve stravě by měl určit, zda taková intervence může být užitečná pro léčbu hepatosteatózy. Celkově by obě části projektů měly poskytnout výsledky, které lze implementovat do praktických dietních doporučení a zlepšit strategie řízení NAFLD.