Sukkers rolle i fedtophobning i leveren (FROGLOSA)

1. INTRODUKTION Ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD) er i øjeblikket den førende årsag til kronisk leversygdom, den rammer cirka en fjerdedel af den globale befolkning, og forekomsten af ​​sygdommen er stadig stigende (doi: 10.1210/endrev/bnz009). Forekomsten af ​​NAFLD er tæt forbundet med fedme, insulinresistens og/eller type 2-diabetes (doi: 10.7759/cureus.20776). Nogle forfattere anser endda NAFLD for at være hepatisk manifestation af metabolisk syndrom eller endda forløberen for udvikling af metabolisk syndrom (doi: 10.1016/j.dld.2014.09.020).

   Den voksende forekomst af NAFLD er blevet tilskrevet stillesiddende livsstil, energiindtag utilstrækkeligt til energiforbrug og også til øget indtag af simple kulhydrater (tilsat sukker), og specifikt øget indtag af fruktose (både som en del af saccharosemolekyle og også , især i USA (USA), som en komponent af majssirup med høj fructose (HFCS)). I løbet af de sidste årtier er der blevet præsenteret en række artikler, som har vist en sammenhæng mellem øget forbrug af tilsat sukker (især af fruktose) og fedme- og insulinresistens-pandemien (doi: 10.1097/MOL.0b013e3283613bca, doi: 10.1007/s00394-018-1711-4, doi: 10.1016/j.nut.2013.08.014).

   Nylige metaanalyser har dog ikke understøttet den rolle, som øget tilsat sukker- eller fruktoseindtag spiller i udviklingen af ​​fedme, insulinresistens, metabolisk syndrom og type 2-diabetes (doi: 10.1017/S0954422414000067, doi: 10.1007/s006394-13451-3451-13451-1301 ). De antyder snarere, at de tilsatte sukkerarter er skadelige, hvis de er forbundet med utilstrækkeligt øget energiindtag. Det blev endda foreslået, at øget forbrug af fruktose/tilsat sukker kan være en markør for usund livsstil. På den anden side er der ikke så mange data tilgængelige med hensyn til den rolle, som tilsatte sukkerarter og specifikt fructose spiller i udviklingen af ​​fedtlever.

   Dette kan skyldes, at metabolismen af ​​glukose og fruktosemetabolisme i leveren er fundamentalt forskellig (doi: 10.1016/j.jada.2010.06.008, doi: 10.3390/nu9091026, doi: 10.1016/j.cl.nu.20.cl. 022). I modsætning til glucose, som i vid udstrækning metaboliseres af ekstrahepatisk væv, optages og metaboliseres det meste af fruktose direkte af leveren. Desuden er phosphorylering af fructose til fructose-1-phosphat katalyseret af fructokinase/ketohexokinase ikke under nogen feedbackkontrol og resulterer i ukontrolleret produktion af trioso-3-phosphater. Disse kan gå ind i gluconeogenese-vejen og blive yderligere brugt til at fylde glykogen (i tilstand af glykogen-udtømning), men de kan også give et substrat for de novo lipogenese (DNL) og på samme tid hæmme fedtsyreoxidation. Fructose synes også at være en potent aktivator af kulhydrat-responsivt element-bindende protein (ChREBP) regulatorisk vej, der sammen med sterol regulatorisk element-bindende protein (SREBP) fremmer DNL i leveren.

   Det er vigtigt, at på trods af det faktum, at fedtsyrer frigivet fra fedtvæv er hovedkilden til leverfedtet, øges bidraget fra DNL til leverfedtakkumulering markant hos patienter med NAFLD (doi: 10.1172/JCI23621, doi: 10.1053/j .gastro.2013.11.049).

   Undersøgelser, der ser på effekten af ​​fructoseforbrug på leverfedtindholdet (HFC), har ikke nået en klar konklusion. Hos raske forsøgspersoner synes administration af fructose under isokaloriske forhold ikke at have nogen indvirkning på HFC (doi: 10.1093/ajcn/84.6.1374, doi: 10.1093/ajcn/nqz271). Fedt akkumuleredes kun i leveren hos raske forsøgspersoner, når de blev udsat for en diæt med højt indhold af kalorier med højt indhold af fructose (doi: 10.3945/ajcn.2008.27336). Tværtimod ophobede abdominalt overvægtige mænd mere fedt i leveren selv på en isokalorisk høj-fruktosediæt (doi: 10.1111/joim.12632). Interessant nok ophobede overvægtige mænd leverfedt i leveren under hyperkaloriske forhold, men der blev ikke fundet nogen forskel i virkningen på HFC mellem glucose og fruktose (f. doi: 10.1053/j.gastro.2013.07.012).

2. PILOTDATA Glukose og fructose kan have forskellige virkninger i ophobningen af ​​fedt i leveren, hvilket vi har påvist i vores undersøgelser af akutte ændringer af HFC efter indgivelse af næringsstoffer (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.20521.1. ). I disse undersøgelser udviklede og introducerede vi en funktionel test, der gjorde det muligt for os at overvåge akutte ændringer i leverfedt efter en udfordring med højt fedtindhold og/eller simpel kulhydratbelastning. I testen administreres de 150 g fedt til forsøgspersoner i begyndelsen af ​​forsøget, hvorimod kulhydrater (50 g fructose eller glucose) administreres hver 2. time for effektivt at undertrykke lipolysen i fedtvæv som dokumenteret ved undertrykkelse af ikke-esterificeret fedtsyrer (NEFA) koncentration (doi: 10.1093/ajcn/nqy386). På denne måde kan vi begrænse virkningen af ​​fedtsyrer fra fedtvævet på akkumulering af leverfedt, og de resulterende ændringer bør forklares ved bidrag fra kostfedt eller DNL.

   Vigtigt er det, at vi i denne model har vist, at 6 timer efter indtagelse af 150 g fedt (fløde) stiger HFC hos både raske ikke-overvægtige forsøgspersoner med normalt fedtindhold (doi: 10.1093/ajcn/nqy386) og også hos ikke-overvægtige. forsøgspersoner med hepatosteatose (doi: 10.26402/jpp.2021.1.05). Leverfedt stiger også, når fruktose administreres sammen med fedt. Tværtimod forhindrer samtidig administration af glukose med fedt en sådan stigning i HFC (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05).

3. PROJEKTETS RATIONALE De tilsatte sukkerarter repræsenterer mere end 12 % af det daglige energiindtag. Deres rolle i ophobning af leverfedt er hidtil blevet undersøgt med ren glucose eller ren fruktose. Men i det virkelige liv indtager folk ikke ren glukose eller fructose, de indtager fruktose sammen med glukose både som en del af saccharose eller i majssirup med højt fructoseindhold. Det er ikke helt klart, hvordan leverfedtindholdet vil reagere på blandingen af ​​begge sukkerarter. Spørgsmålet om, hvordan samtidig indtagelse af begge hexoser påvirker ophobningen af ​​fedt i leveren, kan være af stor praktisk betydning, og besvarelsen af ​​dette spørgsmål kan i høj grad bidrage til ændringen af ​​kostanbefalinger til NAFLD-behandling.

   Vigtigt er det, da vi ikke var i stand til at påvise forskellen mellem HFC's respons på glukose- og fructoseadministration hos ikke-overvægtige ikke-diabetikere (doi: 10.26402/jpp.2021.1.05), det ville være at foretrække at undersøge de akutte virkninger af disse tre sukkerarter på HFC efter deres samtidige administration med højt fedtindhold.

   Antallet af undersøgelser dokumenterede klart negative virkninger af overdreven fructoseforbrug på metabolisk sundhed. På den anden side, hvis fructose skader menneskers sundhed, ville det være vigtigt at vide, om fruktoserestriktion har en effekt på HFC. Faktisk førte fruktoserestriktion til en signifikant reduktion i leverfedt efter 9 dage hos overvægtige børn (doi: 10.1053/j.gastro.2017.05.043) og efter 6 uger hos overvægtige personer (doi: 10.1093/ajcn/nqaa332). Baseret på vores tidligere resultater, kan det antages, at eliminering af fruktose fra kosten og erstatning af den med stivelse eller glukose effektivt skulle undertrykke leverfedtindholdet selv i løbet af få dage.

4. HYPOTESER

   To hovedhypoteser vil blive testet:

   • Forøgelsen af ​​leverfedtindholdet efter højfedtmængde afstumpes af glucose, men ikke fructose eller saccharose (del A af projektet).
   • Den kortsigtede (7 dage) diætfructoserestriktion resulterer i et fald i leverfedtindholdet (del B af projektet)

5. EKSPERIMENTELT DESIGN Del A Designet af denne del af undersøgelsen vil være det samme som i vores tidligere undersøgelser (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05) bortset fra, at kun to målinger af leverfedtindhold (HFC) ved magnetisk resonansspektroskopi (MRS) vil blive udført under hvert eksperiment. De tre undersøgelser af ca. 8 timers varighed vil blive gennemført i hvert emne i undersøgelsen. Først vil leverfedtindholdet (HFC) blive målt ved hjælp af MRS (30-45 minutter). Kanylen vil derefter blive indsat i den antecubitale vene, og den første blodprøve vil blive udført. Forsøgspersonerne vil derefter modtage 460 ml fløde (høj fedtmængde - 150 g fedt i alt) med frugtte sødet med 50 g af et af sukkerarterne (glukose/fructose/saccharose). To og fire timer senere vil de igen modtage frugtte sødet med samme sukker som på tidspunktet 0 h. Blodet til biokemiske analyser tages derefter efter 0,5, 1, 2 (før te), 2,5, 3, 4 (før te), 4,5, 5 og 6 timer. I løbet af dagen vil forsøgspersonerne ikke få noget mad, og de må kun drikke vand eller frugtte. Målingen af ​​leverfedtindholdet gentages efter 6 timer. Under magnetisk resonans (MR) undersøgelse vil mængden af ​​visceralt fedt også blive målt, og kropssammensætning vil blive bestemt. Rækkefølgen af ​​undersøgelser vil blive randomiseret, og de vil blive udført med mindst to ugers intervaller.

   Emner: To grupper af mandlige frivillige vil blive undersøgt i denne del af projektet - 15 ikke-overvægtige forsøgspersoner (Body Mass Index (BMI) < 30 kg/m2) og 15 overvægtige forsøgspersoner (BMI ˃ 30 kg/m2). Forsøgspersonerne vil være 18 - 70 år, og grupperne vil være aldersvarende. Baseret på vores tidligere undersøgelser med raske mandlige forsøgspersoner skulle antallet af 13 forsøgspersoner i én gruppe være tilstrækkeligt til at detektere 10 ± 10 % stigning i HFC efter fedtbelastningen ved α = 0,05 (to-sidet parret t-test) og β = 0,10 . Det lidt højere antal pr. gruppe dækker de risici, der er forbundet med udelukkelse eller tilbagetrækning af nogle forsøgspersoner under undersøgelsen.

   Eksklusionskriterierne for begge grupper vil være diabetes mellitus (fastende glukose over 7 mmol/l, 2-timers glukose efter oGTT ˃ 11,1 mmol/l eller antidiabetisk behandling) eller andre alvorlige sygdomme (hjerte-kar-sygdomme, kræft osv.), alkohol forbrug ˃ 30 g/dag, fructoseintolerans, brug af lægemidler, der påvirker lipidmetabolismen og intolerance over for MR-undersøgelse (klaustrofobi, metalimplantater osv.). Inden indgangen til undersøgelsen vil forsøgspersonerne underskrive de informerede samtykker med deltagelse i undersøgelsen og genetiske tests, og før hvert forsøg vil de underskrive det informerede samtykke med MR-undersøgelse.

   Del B Emner udvalgt til denne del af undersøgelsen vil først udfylde en detaljeret tre-dages kostoptegnelse, der blandt andet giver os mulighed for at kvantificere deres fructoseforbrug. De vil derefter blive instrueret i detaljer, hvordan de ændrer deres kost for at fjerne fruktose og modtage disse anbefalinger også skriftligt. På den første dag af den syv dage lange diætintervention vil de få udtaget fastende blod, og derefter måles leverfedtindholdet med MRS. Derefter vil de modtage en pakke med glukose og udvalgte fødevarer uden fruktose som supplement til deres kost. I syv dage vil de derefter holde sig til diæten uden fructose og føre den detaljerede kostjournal. På den sidste dag af interventionen vil de få udtaget fastende blod og HFC målt ved MRS igen (efter 168 timer nøjagtigt).

   Emner: Femten forsøgspersoner i alderen 18 til 70 år vil blive inkluderet i undersøgelsen. På samme måde som i del A er et sådant antal forsøgspersoner lidt højere end 13 - et tal, der er tilstrækkeligt til at detektere 10 ± 10 % fald i HFC ved α = 0,05 (to-halet parret t-test) og β = 0,10.

   For at blive inkluderet skal leverfedtindholdet i forsøgspersonerne være højere end 6,2% og mindre end 16,5%, hvilket svarer til steatosis grad 2 (doi: 10.1007/s10334-011-0264-9). Deltagerne i del A af undersøgelsen, der opfylder dette kriterium, kan også indgå i del B. Eksklusionskriterierne vil være de samme som i del A. Inden indgangen til undersøgelsen vil forsøgspersonerne underskrive de informerede samtykker med deltagelse i undersøgelsen og genetiske tests og før hvert forsøg vil de underskrive det informerede samtykke med MR-undersøgelse.

6. METODER MR-spektroskopi (MRS). Standard enkelt voxel spektroskopisekvens med åndedræt (3 Tesla VIDA Siemens magnetisk resonans (MR) system udstyret med multi-kanal overflade kropsspole) vil blive brugt til at måle hepatisk fedtindhold (HFC). MR-billeder i tre anatomiske orienteringer vil blive brugt til at indstille volumen af ​​interesse på 40x30x25 mm. Korrektionen af ​​signalintensiteter til T2-relaksation vil blive udført.

   For at få information om lipidprofilen af ​​levertriglyceriderne (TG) vil MRS-spektrene blive analyseret som beskrevet tidligere (doi: 10.3390/metabo11090625.).

   HISTO MR-billeddannelse (MRI). Proton Density Fat Fraction (PDFF) billeddannelse vil blive målt ved HISTO Siemens protokol godkendt af Food and Drug Administration (FDA). Det inkluderer spektroskopiske, Dixon- og multiekko-Dixon-sekvenser.

   Dataevaluering. MR-spektre vil blive evalueret ved hjælp af LCModel (doi: 10.1002/nbm.698) og procentdelen af ​​HFC vurderet af MRS vil blive beregnet i henhold til Longo (doi: 10.1002/jmri.1880050311).

   Måling af visceralt fedtindhold ved MR-billeddannelse. Indholdet af visceralt fedt vil blive målt ved turbo spin ekkosekvens før eller efter PDFF måling. For at evaluere mængden af ​​visceralt og subkutant fedt vil software skrevet i MATLAB blive brugt. For at reducere operatørens påvirkning vil områder med visceralt fedt blive evalueret af to uafhængige eksperter.

   Kropssammensætning. Kropssammensætningen under screeningen vil blive bestemt ved hjælp af InBody.

   Biokemisk analyse. Blodet vil blive opsamlet i rør indeholdende alle nødvendige inhibitorer, straks anbragt på isen og centrifugeret for at opsamle plasma inden for 15 min. Glucose, triglycerid (TG), ikke-esterificerede fedtsyrer (NEFA), insulin og β-hydroxybutyrat vil blive målt i alle prøverne opnået i undersøgelsen. Alle de nødvendige biokemiske, radioimmunoassay (RIA) og enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) metoder til bestemmelse af disse parametre er i øjeblikket i brug i ansøgernes laboratorier.

   Lipidomics. VLDL'en vil blive isoleret ved ultracentrifugering, og analysen af ​​fedtsyreprofilen af ​​VLDL-triglycerider og plasmafrie fedtsyrer vil blive udført ved væskekromatografi - massespektrometri (LC-MS) i Metabolomics-afdelingen ved Institut for Fysiologi, Det Tjekkiske Akademi for Videnskaber (betalt service).

   Genetik. Polymorfismer af gener (PNPLA, TM6SF2 og andre), der vides at påvirke akkumulering af leverfedt, vil blive bestemt.

   Statistik. Statistisk dataanalyse og korrelationer vil blive udført med PRISM 9.1 eller JMP software.

7. PROJEKTETS TIDSPLAN 2024: Del A: Udarbejdelse af studieprotokoller, søgning og screening af emner, start af studieeksamenerne i første fag - der vil blive gennemført ca. 20 heldagseksaminer ud af i alt 90 eksamener (3 eksaminer pr. 30 fag). Antallet af emner, der kan studeres, er begrænset af tilgængeligheden af ​​MR-tomograf til forskningsstudier (1 dag om ugen) og kompleksiteten af ​​undersøgelser. Grundlæggende biokemiske analyser vil blive udført kontinuerligt, men alle prøver fra hvert forsøgsperson (30 i alt) vil blive opbevaret ved -80°C og analyseret samtidigt.

Del B: Udarbejdelse af undersøgelsesprotokoller og kostjournaler, der kan bruges til kvantificering af fructoseforbrug. Søgning og screening af emner.

2025: Del A: Screening af fag, studieeksamen - min. Der vil blive gennemført 30 heldagsprøver. Fortsættelse af biokemiske analyser.

Del B: Screening af forsøgspersoner (fag med hepatosteatose undersøgt i del A kan også indgå i del B). Kostinterventionsforsøg (ca. n=20) på ca. 10 forsøgspersoner (1 forsøgsperson om ugen kan gribes ind, inklusive MR-undersøgelse og natten over isolering af VLDL på første og sidste dag af intervention). Biokemiske analyser.

2026: Del A: Screening af fag, studieeksamener - min. Der vil blive gennemført 30 heldagsprøver. Fortsættelse af biokemiske analyser. Start på intensiv dataanalyse.

Del B: Screening af fag. Diætinterventionsforsøg (n = 10) i resterende forsøgspersoner på den første og sidste dag af intervention. Biokemiske analyser. Specialiserede biokemiske analyser (for eksempel ELISA for fibroblast rowth factor 19 (FGF-19), udvalgte hepatokiner eller andre proteiner, der kan være involveret i regulering af de novo lipogenese) og lipidomanalyse af fedtsyreprofil i fri fedtsyre (FFA) pool og TG i VLDL. Analyse af data og offentliggørelse af resultater.

2027: Del A: Studieeksamen i resterende fag - max. Der vil blive gennemført 10 heldagsprøver. Fortsættelse af rutinemæssige biokemiske analyser. Specialiserede biokemiske analyser (se ovenfor). Analyse af data og offentliggørelse af resultater.

Del B: Endelig analyse af data og offentliggørelse af resultater.

8. FORVENTEDE RESULTATER Dette projekt vil give ny indsigt i de mekanismer, hvorved simple kulhydrater påvirker ophobningen af ​​leverfedt. Af særlig betydning vil det være at sammenligne rollen af ​​fructose og glucose (som er intensivt undersøgt, men ikke brugt af befolkningen) og rollen for saccharose, det sukker, der generelt bruges til at søde af hele befolkningen. Desuden skulle forsøget med fructoserestriktion fra kosten afgøre, om en sådan intervention kan være nyttig til behandling af hepatosteatose. I det hele taget skal begge dele af projekterne give de resultater, der kan implementeres i praktiske kostanbefalinger og forbedre strategierne for håndtering af NAFLD.