O papel dos açúcares no acúmulo de gordura no fígado (FROGLOSA)

1. INTRODUÇÃO A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é atualmente a principal causa de doença hepática crônica, afeta aproximadamente um quarto da população global e a incidência da doença ainda está aumentando (doi: 10.1210/endrev/bnz009). A ocorrência de DHGNA está fortemente associada à obesidade, resistência à insulina e/ou diabetes tipo 2 (doi: 10.7759/cureus.20776). Alguns autores chegam a considerar a DHGNA como manifestação hepática da síndrome metabólica ou mesmo precursora do desenvolvimento da síndrome metabólica (doi: 10.1016/j.dld.2014.09.020).

   A crescente incidência de DHGNA tem sido atribuída ao estilo de vida sedentário, à ingestão energética inadequada ao gasto energético e também ao aumento da ingestão de carboidratos simples (açúcares adicionados) e, especificamente, ao aumento da ingestão de frutose (tanto como parte da molécula de sacarose como também , especialmente nos Estados Unidos (EUA), como componente do xarope de milho rico em frutose (HFCS)). Nas últimas décadas, foram apresentados vários artigos que demonstraram uma ligação entre o aumento do consumo de açúcares adicionados (especialmente de frutose) e a pandemia de obesidade e resistência à insulina (doi: 10.1097/MOL.0b013e3283613bca, doi: 10.1007/s00394-018-1711-4, doi: 10.1016/j.nut.2013.08.014).

   No entanto, metanálises recentes não apoiaram o papel do aumento da ingestão de açúcar adicionado ou frutose no desenvolvimento de obesidade, resistência à insulina, síndrome metabólica e diabetes tipo 2 (doi: 10.1017/S0954422414000067, doi: 10.1007/s00394-016-1345-3 ). Em vez disso, sugerem que os açúcares adicionados são prejudiciais se associados a um aumento inadequado da ingestão de energia. Foi até sugerido que o aumento do consumo de frutose/açúcares adicionados pode ser um marcador de estilo de vida pouco saudável. Por outro lado, não existem muitos dados disponíveis no que diz respeito ao papel dos açúcares adicionados e, especificamente, da frutose, no desenvolvimento do fígado gorduroso.

   Isso pode ser devido ao fato de que o metabolismo da glicose e da frutose no fígado é fundamentalmente diferente (doi: 10.1016/j.jada.2010.06.008, doi: 10.3390/nu9091026, doi: 10.1016/j.clnu.2020.12. 022). Ao contrário da glicose, que é amplamente metabolizada pelos tecidos extra-hepáticos, a maior parte da frutose é diretamente captada e metabolizada pelo fígado. Além disso, a fosforilação da frutose em frutose-1-fosfato catalisada pela frutoquinase/cetohexoquinase não está sob qualquer controle de feedback e resulta na produção descontrolada de trioso-3-fosfatos. Estes podem entrar na via da gliconeogênese e ser posteriormente usados ​​para repor o glicogênio (em estado de depleção de glicogênio), mas também podem fornecer um substrato para a lipogênese de novo (DNL) e, ao mesmo tempo, inibir a oxidação de ácidos graxos. A frutose parece ser também um potente ativador da via regulatória da proteína de ligação ao elemento responsivo a carboidratos (ChREBP) que, juntamente com a proteína de ligação ao elemento regulador de esterol (SREBP), promove DNL no fígado.

   É importante ressaltar que, apesar do fato de os ácidos graxos liberados do tecido adiposo serem a principal fonte de gordura hepática, a contribuição do DNL para o acúmulo de gordura hepática aumenta significativamente especificamente em pacientes com DHGNA (doi: 10.1172/JCI23621, doi: 10.1053/j .gastro.2013.11.049).

   Os estudos que analisam o efeito do consumo de frutose no teor de gordura hepática (HFC) não chegaram a uma conclusão clara. Em indivíduos saudáveis, a administração de frutose sob condições isocalóricas não parece ter qualquer impacto no HFC (doi: 10.1093/ajcn/84.6.1374, doi: 10.1093/ajcn/nqz271). Gordura acumulada no fígado de indivíduos saudáveis ​​somente quando expostos a uma dieta hipercalórica rica em frutose (doi: 10.3945/ajcn.2008.27336). Pelo contrário, homens com obesidade abdominal acumularam mais gordura no fígado, mesmo com uma dieta isocalórica rica em frutose (doi: 10.1111/joim.12632). Curiosamente, no estudo que comparou uma dieta rica em glicose e rica em frutose sob condições iso e hipercalóricas, os homens com excesso de peso acumularam gordura hepática no fígado apenas sob condições hipercalóricas, mas não foi encontrada diferença no efeito sobre o HFC entre glicose e frutose ( doi: 10.1053/j.gastro.2013.07.012).

2. DADOS PILOTO A glicose e a frutose podem ter efeitos diferentes no acúmulo de gordura no fígado, o que demonstramos em nossos estudos de alterações agudas de HFC após a administração de nutrientes (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05 ). Nestes estudos desenvolvemos e introduzimos um teste funcional que nos permitiu monitorar alterações agudas na gordura hepática após um desafio com carga rica em gordura e/ou carboidratos simples. No teste, 150 g de gordura são administrados aos indivíduos no início do experimento, enquanto carboidratos (50 g de frutose ou glicose) são administrados a cada 2 horas para suprimir eficientemente a lipólise no tecido adiposo, conforme documentado pela supressão de gordura não esterificada. concentração de ácidos graxos (NEFA) (doi: 10.1093/ajcn/nqy386). Desta forma podemos limitar o impacto dos ácidos gordos do tecido adiposo na acumulação de gordura hepática e as alterações resultantes devem ser explicadas pela contribuição da gordura dietética ou DNL.

   É importante ressaltar que neste modelo mostramos que 6 horas após o consumo de 150 g de gordura (creme), o HFC aumenta tanto em indivíduos saudáveis ​​não obesos com teor normal de gordura (doi: 10.1093/ajcn/nqy386) quanto em indivíduos não obesos. indivíduos com hepatoesteatose (doi: 10.26402/jpp.2021.1.05). A gordura hepática também aumenta quando a frutose é coadministrada com gordura. Pelo contrário, a coadministração de glicose com gordura evita esse aumento de HFC (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05).

3. A JUSTIFICATIVA DO PROJETO Os açúcares adicionados representam mais de 12% da ingestão energética diária. O seu papel na acumulação de gordura no fígado foi estudado até agora com glicose pura ou frutose pura. No entanto, na vida real as pessoas não consomem glicose ou frutose pura, elas consomem frutose juntamente com glicose, tanto na sacarose quanto no xarope de milho rico em frutose. Não está totalmente claro como o teor de gordura hepática responderá à mistura de ambos os açúcares. A questão de como o consumo simultâneo de ambas as hexoses afeta o acúmulo de gordura no fígado pode ser de grande significado prático e responder a essa questão pode contribuir muito para a modificação das recomendações dietéticas para o tratamento da DHGNA.

   É importante ressaltar que, como não conseguimos demonstrar a diferença entre a resposta do HFC à administração de glicose e frutose em indivíduos não obesos e não diabéticos (doi: 10.26402/jpp.2021.1.05), seria preferível estudar os efeitos agudos destes três açúcares no HFC após a sua co-administração com carga elevada de gordura.

   O número de estudos documentou claramente os efeitos adversos do consumo excessivo de frutose na saúde metabólica. Por outro lado, se a frutose prejudica a saúde humana, seria importante saber se a restrição da frutose tem efeito sobre o HFC. Na verdade, a restrição de frutose levou a uma redução significativa na gordura hepática após 9 dias em crianças obesas (doi: 10.1053/j.gastro.2017.05.043) e após 6 semanas em indivíduos obesos (doi: 10.1093/ajcn/nqaa332). Com base em nossos resultados anteriores, pode-se levantar a hipótese de que eliminar a frutose da dieta e substituí-la por amido ou glicose deveria suprimir efetivamente o conteúdo de gordura hepática, mesmo em poucos dias.

4. HIPÓTESES

   Duas hipóteses principais serão testadas:

   • O aumento do teor de gordura hepática após uma carga elevada de gordura é atenuado pela glicose, mas não pela frutose nem pela sacarose (Parte A do projeto).
   • A restrição dietética de frutose a curto prazo (7 dias) resulta numa diminuição do teor de gordura hepática (Parte B do projeto)

5. DESENHO EXPERIMENTAL Parte A O desenho desta parte do estudo será o mesmo de nossos estudos anteriores (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05) exceto que apenas duas medições do conteúdo de gordura hepática (HFC) por espectroscopia de ressonância magnética (MRS) serão realizadas durante cada experimento. Os três exames com duração aproximada de 8 horas serão realizados em cada disciplina do estudo. Primeiro, o conteúdo de gordura hepática (HFC) será medido usando MRS (30-45 minutos). A cânula será então inserida na veia antecubital e será realizada a primeira coleta de sangue. Os sujeitos receberão então 460 ml de creme (alta carga de gordura - 150g de gordura no total) com chá de frutas adoçado com 50 g de um dos açúcares (glicose/frutose/sacarose). Duas e quatro horas depois receberão novamente chá de frutas adoçado com o mesmo açúcar do horário 0 h. O sangue para análises bioquímicas será então coletado às 0,5, 1, 2 (antes do chá), 2,5, 3, 4 (antes do chá), 4,5, 5 e 6 horas. Durante o dia, os sujeitos não receberão nenhum alimento e poderão beber apenas água ou chá de frutas. A medição do teor de gordura hepática será repetida no tempo de 6 horas. Durante o exame de ressonância magnética (RM), o volume de gordura visceral também será medido e a composição corporal será determinada. A ordem dos exames será randomizada e serão realizados em intervalos de pelo menos duas semanas.

   Sujeitos: Dois grupos de voluntários do sexo masculino serão estudados nesta parte do projeto - 15 indivíduos não obesos (Índice de Massa Corporal (IMC) < 30 kg/m2) e 15 indivíduos obesos (IMC ˃ 30 kg/m2). Os sujeitos terão de 18 a 70 anos e os grupos serão pareados por idade. Com base em nossos estudos anteriores com indivíduos saudáveis ​​do sexo masculino, o número de 13 indivíduos em um grupo deve ser suficiente para detectar um incremento de 10 ± 10% no HFC após a carga de gordura em α = 0,05 (teste t pareado bicaudal) e β = 0,10 . O número ligeiramente superior por grupo cobre os riscos associados à exclusão ou retirada de alguns sujeitos durante o estudo.

   Os critérios de exclusão para ambos os grupos serão diabetes mellitus (glicemia de jejum acima de 7 mmol/l, glicemia de 2 horas após oGTT ˃ 11,1 mmol/l, ou tratamento antidiabético) ou outras doenças graves (doenças cardiovasculares, câncer, etc.), álcool consumo ˃ 30 g/dia, intolerância à frutose, uso de medicamentos que afetam o metabolismo lipídico e intolerância ao exame de RM (claustrofobia, implantes metálicos, etc.). Antes da entrada no estudo, os sujeitos assinarão o consentimento informado com participação no estudo e testes genéticos e antes de cada experimento assinarão o consentimento informado com exame de RM.

   Parte B Os indivíduos selecionados para esta parte do estudo irão primeiro preencher um registro dietético detalhado de três dias, permitindo-nos quantificar seu consumo de frutose, entre outras coisas. Eles serão então instruídos detalhadamente sobre como mudar sua dieta para eliminar a frutose e receberão essas recomendações também por escrito. No primeiro dia da intervenção dietética de sete dias, eles farão coleta de sangue em jejum e, em seguida, o teor de gordura hepática será medido por MRS. Em seguida receberão um pacote de glicose e alimentos selecionados sem frutose para complementar a dieta. Durante sete dias eles aderirão à dieta sem frutose e manterão o registro alimentar detalhado. No último dia da intervenção, eles farão coleta de sangue em jejum e HFC medido novamente por MRS (exatamente após 168 horas).

   Sujeitos: Quinze sujeitos de 18 a 70 anos serão incluídos no estudo. Da mesma forma que na Parte A, esse número de indivíduos é ligeiramente superior a 13 - um número suficiente para detectar uma diminuição de 10 ± 10% no HFC em α = 0,05 (teste t pareado bicaudal) e β = 0,10.

   Para ser incluído, o teor de gordura hepática nos indivíduos deve ser superior a 6,2% e inferior a 16,5%, o que corresponde à esteatose grau 2 (doi: 10.1007/s10334-011-0264-9). Os participantes da Parte A do estudo que atendam a este critério também podem ser incluídos na Parte B. Os critérios de exclusão serão os mesmos da Parte A. Antes da entrada no estudo, os sujeitos assinarão o consentimento informado com participação no estudo e testes genéticos e antes de cada experimento assinarão o termo de consentimento livre e esclarecido com exame de RM.

6. MÉTODOS Espectroscopia de RM (MRS). Sequência de espectroscopia de voxel único padrão com retenção da respiração (sistema de ressonância magnética (MR) 3 Tesla VIDA Siemens equipado com bobina de superfície corporal multicanal) será usada para medir o conteúdo de gordura hepática (HFC). Imagens de RM em três orientações anatômicas serão utilizadas para definir o volume de interesse de 40x30x25 mm. Será feita a correção das intensidades do sinal para relaxamento T2.

   Para obter informações sobre o perfil lipídico dos triglicerídeos hepáticos (TG), os espectros MRS serão analisados ​​conforme descrito anteriormente (doi: 10.3390/metabo11090625.).

   Imagem HISTO MR (MRI). A imagem da fração de gordura de densidade de prótons (PDFF) será medida pelo protocolo HISTO Siemens aprovado pela Food and Drug Administration (FDA). Inclui sequências espectroscópicas, Dixon e multieco Dixon.

   Avaliação de dados. Os espectros de RM serão avaliados usando o LCModel (doi: 10.1002/nbm.698) e o percentual de HFC avaliado pela MRS será calculado de acordo com Longo (doi: 10.1002/jmri.1880050311).

   Medição do conteúdo de gordura visceral por imagens de ressonância magnética. O conteúdo de gordura visceral será medido pela sequência turbo spin echo antes ou depois da medição do PDFF. Para avaliar o volume de gordura visceral e subcutânea será utilizado software escrito em MATLAB. Para reduzir o impacto do operador, as áreas de gordura visceral serão avaliadas por dois especialistas independentes.

   Composição corporal. A composição corporal durante a triagem será determinada pelo InBody.

   Análise bioquímica. O sangue será coletado em tubos contendo todos os inibidores necessários, imediatamente colocados no gelo e centrifugados para coleta de plasma em 15 min. Glicose, triglicerídeos (TG), ácidos graxos não esterificados (NEFA), insulina e β-hidroxibutirato serão medidos em todas as amostras obtidas no estudo. Todos os métodos bioquímicos, de radioimunoensaio (RIA) e de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) necessários para a determinação destes parâmetros estão actualmente em utilização nos laboratórios dos requerentes.

   Lipidômica. O VLDL será isolado por ultracentrifugação, e a análise do perfil de ácidos graxos dos triglicerídeos VLDL e dos ácidos graxos livres plasmáticos será realizada por cromatografia líquida - espectrometria de massa (LC-MS) no departamento de Metabolômica do Instituto de Fisiologia, Academia Tcheca de Ciências (serviço pago).

   Genética. Serão determinados os polimorfismos de genes (PNPLA, TM6SF2 e outros) conhecidos por afetar o acúmulo de gordura hepática.

   Estatísticas. A análise estatística dos dados e as correlações serão realizadas com o software PRISM 9.1 ou JMP.

7. CRONOGRAMA DE TEMPO DO PROJETO 2024: Parte A: Preparação de protocolos de estudo, busca e triagem de sujeitos, início dos exames de estudo nas primeiras disciplinas - serão realizados aproximadamente 20 exames de dia inteiro de um total de 90 exames (3 exames para cada um dos 30 assuntos). O número de disciplinas que podem ser estudadas é limitado pela disponibilidade de tomógrafos de RM para pesquisas (1 dia por semana) e pela complexidade dos exames. As análises bioquímicas básicas serão realizadas continuamente, mas todas as amostras de cada sujeito (30 no total) serão armazenadas a -80°C e analisadas simultaneamente.

Parte B: Preparação de protocolos de estudo e registros dietéticos que podem ser utilizados para quantificação do consumo de frutose. Pesquisa e triagem de assuntos.

2025: Parte A: Triagem de disciplinas, exames de estudo - min. Serão realizados 30 exames durante todo o dia. Continuação das análises bioquímicas.

Parte B: Triagem de indivíduos (indivíduos com hepatoesteatose estudados na Parte A também podem ser incluídos na Parte B). Experimentos de intervenção dietética (aprox. n=20) em aprox. 10 sujeitos (pode ser intervencionado 1 sujeito por semana, incluindo exame de RM e isolamento noturno de VLDL no primeiro e no último dia de intervenção). Análises bioquímicas.

2026: Parte A: Triagem de disciplinas, exames de estudo - min. Serão realizados 30 exames durante todo o dia. Continuação das análises bioquímicas. Início da análise intensiva de dados.

Parte B: Triagem de sujeitos. Experimentos de intervenção dietética (n = 10) nos demais indivíduos no primeiro e no último dia de intervenção. Análises bioquímicas. Análises bioquímicas especializadas (por exemplo, ELISA para fator de crescimento de fibroblastos 19 (FGF-19), hepatocinas selecionadas ou outras proteínas que podem estar envolvidas na regulação da lipogênese de novo) e análise lipidômica do perfil de ácidos graxos em pool de ácidos graxos livres (FFA) e TG em VLDL. Análise dos dados e publicação dos resultados.

2027: Parte A: Exames de estudo nas restantes disciplinas - máx. Serão realizados 10 exames durante todo o dia. Continuação das análises bioquímicas de rotina. Análises bioquímicas especializadas (ver acima). Análise dos dados e publicação dos resultados.

Parte B: Análise final dos dados e publicação dos resultados.

8. RESULTADOS ANTECIPADOS Este projeto fornecerá novos insights sobre os mecanismos pelos quais os carboidratos simples afetam o acúmulo de gordura no fígado. De particular importância será a comparação do papel da frutose e da glicose (que são intensamente estudadas mas não utilizadas pela população) e o da sacarose, o açúcar geralmente utilizado para adoçar por toda a população. Além disso, o experimento com restrição de frutose na dieta deve determinar se tal intervenção pode ser útil para o tratamento da hepatoesteatose. No geral, ambas as partes dos projectos deverão fornecer resultados que possam ser implementados em recomendações dietéticas práticas e melhorar as estratégias de gestão da DHGNA.