Rola cukrów w gromadzeniu się tłuszczu w wątrobie (FROGLOSA)

1. WSTĘP Niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD) jest obecnie główną przyczyną przewlekłych chorób wątroby, dotyka około jednej czwartej światowej populacji, a częstość występowania tej choroby wciąż rośnie (doi: 10.1210/endrev/bnz009). Występowanie NAFLD jest ściśle powiązane z otyłością, insulinoopornością i/lub cukrzycą typu 2 (doi: 10.7759/cureus.20776). Niektórzy autorzy uważają nawet NAFLD za wątrobową manifestację zespołu metabolicznego, a nawet prekursor rozwoju zespołu metabolicznego (doi: 10.1016/j.dld.2014.09.020).

   Rosnącą częstość występowania NAFLD przypisuje się siedzącemu trybowi życia, spożyciu energii niewystarczającej do wydatku energetycznego, a także zwiększonemu spożyciu węglowodanów prostych (cukrów dodanych), a w szczególności zwiększonemu spożyciu fruktozy (zarówno jako części cząsteczki sacharozy, jak i również , szczególnie w Stanach Zjednoczonych (USA), jako składnik wysokofruktozowego syropu kukurydzianego (HFCS)). Na przestrzeni ostatnich dziesięcioleci pojawiło się wiele prac, które wykazały związek zwiększonego spożycia cukrów dodanych (zwłaszcza fruktozy) z pandemią otyłości i insulinooporności (doi: 10.1097/MOL.0b013e3283613bca, doi: 10.1007/s00394-018-1711-4, doi: 10.1016/j.nut.2013.08.014).

   Jednak ostatnie metaanalizy nie potwierdziły roli zwiększonego spożycia dodatku cukru lub fruktozy w rozwoju otyłości, insulinooporności, zespołu metabolicznego i cukrzycy typu 2 (doi: 10.1017/S0954422414000067, doi: 10.1007/s00394-016-1345-3 ). Sugerują raczej, że dodane cukry są szkodliwe, jeśli są powiązane z nieodpowiednio zwiększonym spożyciem energii. Sugerowano nawet, że zwiększone spożycie fruktozy/cukrów dodanych może być oznaką niezdrowego stylu życia. Z drugiej strony nie ma zbyt wielu danych na temat roli dodanych cukrów, a w szczególności fruktozy, w rozwoju stłuszczenia wątroby.

   Może to wynikać z faktu, że metabolizm glukozy i metabolizm fruktozy w wątrobie jest zasadniczo różny (doi: 10.1016/j.jada.2010.06.008, doi: 10.3390/nu9091026, doi: 10.1016/j.clnu.2020.12. 022). W przeciwieństwie do glukozy, która jest metabolizowana głównie w tkankach pozawątrobowych, większość fruktozy jest bezpośrednio pobierana i metabolizowana przez wątrobę. Co więcej, fosforylacja fruktozy do fruktozo-1-fosforanu katalizowana przez fruktokinazę/ketoheksokinazę nie podlega żadnej kontroli ze sprzężeniem zwrotnym i powoduje niekontrolowane wytwarzanie trioso-3-fosforanów. Mogą one wejść na szlak glukoneogenezy i zostać dalej wykorzystane do uzupełnienia glikogenu (w stanie wyczerpania glikogenu), ale mogą również stanowić substrat dla lipogenezy de novo (DNL) i jednocześnie hamować utlenianie kwasów tłuszczowych. Fruktoza wydaje się być także silnym aktywatorem szlaku regulacyjnego białka wiążącego elementy reagujące na węglowodany (ChREBP), które wraz z białkiem wiążącym elementy regulujące sterol (SREBP) sprzyja DNL w wątrobie.

   Co ważne, pomimo faktu, że kwasy tłuszczowe uwalniane z tkanki tłuszczowej są głównym źródłem tłuszczu wątrobowego, udział DNL w akumulacji tłuszczu w wątrobie znacząco wzrasta szczególnie u pacjentów z NAFLD (doi: 10.1172/JCI23621, doi: 10.1053/j .gastro.2013.11.049).

   Badania oceniające wpływ spożycia fruktozy na zawartość tłuszczu w wątrobie (HFC) nie dały jednoznacznych wniosków. Wydaje się, że u zdrowych osób podawanie fruktozy w warunkach izokalorycznych nie ma żadnego wpływu na HFC (doi: 10.1093/ajcn/84.6.1374, doi: 10.1093/ajcn/nqz271). Tłuszcz gromadził się w wątrobach zdrowych osób tylko pod wpływem hiperkalorycznej diety bogatej w fruktozę (doi: 10.3945/ajcn.2008.27336). Wręcz przeciwnie, mężczyźni z otyłością brzuszną gromadzili więcej tłuszczu w wątrobie nawet na izokalorycznej diecie bogatej w fruktozę (doi: 10.1111/joim.12632). Co ciekawe, w badaniu porównującym dietę wysokoglukozową i wysokofruktozową zarówno w warunkach izo-, jak i hiperkalorycznych, mężczyźni z nadwagą gromadzili tłuszcz wątrobowy w wątrobie tylko w warunkach hiperkalorycznych, ale nie stwierdzono żadnej różnicy w wpływie na HFC pomiędzy glukozą i fruktozą ( doi: 10.1053/j.gastro.2013.07.012).

2. DANE PILOTAŻOWE Glukoza i fruktoza mogą mieć różny wpływ na gromadzenie się tłuszczu w wątrobie, co wykazaliśmy w naszych badaniach ostrych zmian HFC po podaniu składników odżywczych (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05 ). W tych badaniach opracowaliśmy i wprowadziliśmy test funkcjonalny, który pozwolił nam monitorować ostre zmiany w zawartości tłuszczu w wątrobie po prowokacji obciążeniem wysokotłuszczowym i/lub prostymi węglowodanami. W teście na początku eksperymentu pacjentom podaje się 150 g tłuszczu, natomiast węglowodany (50 g fruktozy lub glukozy) co 2 godziny, aby skutecznie stłumić lipolizę w tkance tłuszczowej, co udokumentowano supresją nieestryfikowanych stężenie kwasów tłuszczowych (NEFA) (doi: 10,1093/ajcn/nqy386). W ten sposób można ograniczyć wpływ kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej na akumulację tłuszczu w wątrobie, a powstałe zmiany należy tłumaczyć udziałem tłuszczu w diecie, czyli DNL.

   Co ważne, w tym modelu wykazaliśmy, że po 6 godzinach od spożycia 150 g tłuszczu (kremu) HFC wzrasta zarówno u zdrowych, nieotyłych osób z prawidłową zawartością tłuszczu (doi: 10.1093/ajcn/nqy386), jak i u osób nieotyłych. pacjenci z stłuszczeniem wątroby (doi: 10.26402/jpp.2021.1.05). Tłuszcz w wątrobie zwiększa się także w przypadku jednoczesnego podawania fruktozy z tłuszczami. Wręcz przeciwnie, jednoczesne podawanie glukozy z tłuszczem zapobiega takiemu wzrostowi HFC (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05).

3. UZASADNIENIE PROJEKTU Dodane cukry stanowią ponad 12% dziennego zapotrzebowania energetycznego. Ich rolę w akumulacji tłuszczu wątrobowego badano dotychczas w przypadku czystej glukozy lub czystej fruktozy. Jednak w prawdziwym życiu ludzie nie spożywają czystej glukozy ani fruktozy, lecz fruktozę razem z glukozą zarówno w postaci sacharozy, jak i w wysokofruktozowym syropie kukurydzianym. Nie jest do końca jasne, jak zawartość tłuszczu w wątrobie będzie reagować na mieszaninę obu cukrów. Pytanie, w jaki sposób jednoczesne spożywanie obu heksoz wpływa na gromadzenie się tłuszczu w wątrobie, może mieć ogromne znaczenie praktyczne, a udzielenie odpowiedzi na to pytanie może w znacznym stopniu przyczynić się do modyfikacji zaleceń dietetycznych w leczeniu NAFLD.

   Co ważne, ponieważ nie byliśmy w stanie wykazać różnicy pomiędzy reakcją HFC na podanie glukozy i fruktozy u osób nieotyłych i nie chorych na cukrzycę (doi: 10.26402/jpp.2021.1.05), byłoby lepiej zbadać ostry wpływ tych trzech cukrów na HFC po ich jednoczesnym podaniu z ładunkiem o dużej zawartości tłuszczu.

   Liczba badań jasno udokumentowała niekorzystny wpływ nadmiernego spożycia fruktozy na zdrowie metaboliczne. Z drugiej strony, jeśli fruktoza rzeczywiście szkodzi zdrowiu ludzkiemu, ważne jest, aby wiedzieć, czy ograniczenie spożycia fruktozy ma wpływ na HFC. Rzeczywiście, ograniczenie fruktozy doprowadziło do znacznej redukcji tkanki tłuszczowej w wątrobie po 9 dniach u otyłych dzieci (doi: 10.1053/j.gastro.2017.05.043) i po 6 tygodniach u osób otyłych (doi: 10.1093/ajcn/nqaa332). Na podstawie naszych wcześniejszych wyników można postawić hipotezę, że wyeliminowanie fruktozy z diety i zastąpienie jej skrobią lub glukozą powinno skutecznie obniżyć zawartość tłuszczu w wątrobie nawet w ciągu kilku dni.

4. HIPOTEZY

   Zostaną przetestowane dwie główne hipotezy:

   • Wzrost zawartości tłuszczu w wątrobie po obciążeniu wysokotłuszczowym jest tłumiony przez glukozę, ale nie fruktozę ani sacharozę (Część A projektu).
   • Krótkoterminowe (7 dni) ograniczenie diety fruktozy skutkuje zmniejszeniem zawartości tłuszczu w wątrobie (Część B projektu)

5. PROJEKT EKSPERYMENTALNY Część A Projekt tej części badania będzie taki sam jak w naszych poprzednich badaniach (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05) z tym wyjątkiem, że podczas każdego eksperymentu zostaną przeprowadzone tylko dwa pomiary zawartości tłuszczu w wątrobie (HFC) za pomocą spektroskopii rezonansu magnetycznego (MRS). Z każdego przedmiotu objętego badaniem zostaną przeprowadzone trzy egzaminy trwające około 8 godzin. Najpierw zostanie zmierzona zawartość tłuszczu w wątrobie (HFC) za pomocą MRS (30–45 minut). Następnie kaniula zostanie wprowadzona do żyły łokciowej i zostanie wykonane pierwsze pobranie krwi. Następnie badani otrzymywali 460 ml śmietanki (wysoka zawartość tłuszczu – łącznie 150 g tłuszczu) z herbatą owocową słodzoną 50 g jednego z cukrów (glukoza/fruktoza/sacharoza). Dwie i cztery godziny później ponownie otrzymają herbatę owocową słodzoną tym samym cukrem co w godzinie 0. Krew do badań biochemicznych będzie następnie pobierana po 0,5, 1, 2 (przed herbatą), 2,5, 3, 4 (przed herbatą), 4,5, 5 i 6 godzinach. W ciągu dnia badani nie będą otrzymywać żadnego pożywienia i będą mogli pić wyłącznie wodę lub herbatę owocową. Pomiar zawartości tłuszczu w wątrobie zostanie powtórzony po 6 godzinach. Podczas badania rezonansem magnetycznym (MR) zostanie również zmierzona objętość trzewnej tkanki tłuszczowej oraz określony skład ciała. Kolejność badań będzie losowa i będą przeprowadzane w odstępach co najmniej dwutygodniowych.

   Badani: W tej części projektu badane będą dwie grupy ochotników płci męskiej – 15 osób nieotyłych (BMI) < 30 kg/m2) i 15 osób otyłych (BMI ˃ 30 kg/m2). Uczestnicy będą mieli od 18 do 70 lat, a grupy będą dobrane pod względem wieku. Na podstawie naszych wcześniejszych badań z udziałem zdrowych mężczyzn liczba 13 osób w jednej grupie powinna wystarczyć do wykrycia 10 ± 10% wzrostu HFC po obciążeniu tłuszczem przy α = 0,05 (dwustronny test t dla par) i β = 0,10 . Nieco wyższa liczba na grupę obejmuje ryzyko związane z wykluczeniem lub wycofaniem niektórych uczestników w trakcie badania.

   Kryteriami wykluczenia dla obu grup będzie cukrzyca (glikemia na czczo powyżej 7 mmol/l, glikemia 2-godzinna po oGTT ˃ 11,1 mmol/l lub leczenie przeciwcukrzycowe) lub inna poważna choroba (choroby układu krążenia, nowotwory itp.), alkohol spożycie ˃ 30 g/dzień, nietolerancja fruktozy, stosowanie leków wpływających na metabolizm lipidów i nietolerancja badania MR (klaustrofobia, metalowe implanty itp.). Przed przystąpieniem do badania uczestnicy podpiszą świadomą zgodę na udział w badaniu i badaniach genetycznych, a przed każdym eksperymentem podpiszą świadomą zgodę na badanie MR.

   Część B Osoby wybrane do tej części badania najpierw wypełnią szczegółowy trzydniowy zapis diety, pozwalający między innymi określić ilościowo spożycie fruktozy. Następnie zostaną szczegółowo poinstruowani, jak zmienić dietę, aby wyeliminować fruktozę i otrzymają te zalecenia również w formie pisemnej. W pierwszym dniu siedmiodniowej interwencji dietetycznej zostanie im pobrana krew na czczo, a następnie zmierzona zostanie zawartość tłuszczu w wątrobie metodą MRS. Następnie otrzymają paczkę z glukozą i wybranymi pokarmami bez fruktozy jako uzupełnienie swojej diety. Następnie przez siedem dni będą przestrzegać diety bez fruktozy i prowadzić szczegółowy zapis diety. Ostatniego dnia interwencji zostanie im pobrana krew na czczo i ponownie zmierzona zawartość HFC metodą MRS (dokładnie po 168 godzinach).

   Pacjenci: Badaniem zostanie objętych piętnastu pacjentów w wieku od 18 do 70 lat. Podobnie jak w części A, liczba ta jest nieco większa niż 13 – liczba wystarczająca do wykrycia 10 ± 10% spadku HFC przy α = 0,05 (dwustronny test t dla par) i β = 0,10.

   Aby zostać uwzględnionym, zawartość tłuszczu w wątrobie u pacjentów musi być wyższa niż 6,2% i mniejsza niż 16,5%, co odpowiada 2. stopniowi stłuszczenia (doi: 10.1007/s10334-011-0264-9). Uczestnicy Części A badania spełniający to kryterium mogą zostać włączeni także do Części B. Kryteria wykluczenia będą takie same jak w Części A. Przed przystąpieniem do badania osoby badane podpiszą świadomą zgodę na udział w badaniu oraz badań genetycznych, a przed każdym eksperymentem podpiszą świadomą zgodę na badanie MR.

6. METODY Spektroskopia MR (MRS). Do pomiaru zawartości tłuszczu w wątrobie (HFC) zostanie zastosowana standardowa sekwencja spektroskopii pojedynczego woksela z wstrzymywaniem oddechu (system rezonansu magnetycznego (MR) 3 Tesli VIDA Siemens wyposażony w wielokanałową cewkę powierzchniową). Obrazy MR w trzech orientacjach anatomicznych zostaną użyte do ustawienia interesującej objętości na 40x30x25 mm. Nastąpi korekta intensywności sygnału na relaksację T2.

   Aby uzyskać informacje na temat profilu lipidowego trójglicerydów wątrobowych (TG), widma MRS zostaną przeanalizowane w sposób opisany wcześniej (doi: 10.3390/metabo11090625.).

   Obrazowanie HISTO MR (MRI). Obrazowanie frakcji tłuszczu o gęstości protonowej (PDFF) będzie mierzone zgodnie z protokołem HISTO Siemens zatwierdzonym przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA). Obejmuje sekwencje spektroskopowe, Dixona i multiecho Dixona.

   Ocena danych. Widma MR zostaną ocenione przy użyciu LCModel (doi: 10.1002/nbm.698) a procent HFC oceniony przez MRS zostanie obliczony zgodnie z Longo (doi: 10.1002/jmri.1880050311).

   Pomiar zawartości tłuszczu trzewnego za pomocą obrazowania MR. Zawartość tłuszczu trzewnego będzie mierzona za pomocą sekwencji echa turbowirowego przed lub po pomiarze PDFF. Do oceny objętości tkanki tłuszczowej trzewnej i podskórnej zostanie wykorzystany program napisany w języku MATLAB. Aby zmniejszyć wpływ operatora, obszary tkanki tłuszczowej trzewnej zostaną ocenione przez dwóch niezależnych ekspertów.

   Skład ciała. Skład ciała podczas seansu zostanie określony za pomocą programu InBody.

   Analiza biochemiczna. Krew zostanie pobrana do probówek zawierających wszystkie niezbędne inhibitory, natychmiast umieszczona na lodzie i odwirowana w celu pobrania osocza w ciągu 15 minut. We wszystkich próbkach uzyskanych w badaniu oznaczona zostanie glukoza, triglicerydy (TG), nieestryfikowane kwasy tłuszczowe (NEFA), insulina i β-hydroksymaślan. Wszystkie niezbędne metody biochemiczne, radioimmunologiczne (RIA) i enzymatyczne testy immunoenzymatyczne (ELISA) do oznaczania tych parametrów są obecnie stosowane w laboratoriach wnioskodawców.

   Lipidomika. VLDL zostanie wyizolowany poprzez ultrawirowanie, a analiza profilu kwasów tłuszczowych triglicerydów VLDL i wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu zostanie przeprowadzona metodą chromatografii cieczowej – spektrometrii masowej (LC-MS) w Katedrze Metabolomiki Instytutu Fizjologii Czeskiej Akademii Nauki (usługa płatna).

   Genetyka. Określone zostaną polimorfizmy genów (PNPLA, TM6SF2 i inne), o których wiadomo, że wpływają na akumulację tłuszczu w wątrobie.

   Statystyka. Analiza danych statystycznych i korelacje zostaną wykonane przy użyciu oprogramowania PRISM 9.1 lub JMP.

7. HARMONOGRAM PROJEKTU 2024: Część A: Przygotowanie protokołów studiów, wyszukiwanie i selekcja przedmiotów, rozpoczęcie egzaminów studyjnych na pierwszych przedmiotach - zostanie zrealizowanych około 20 całodniowych egzaminów z łącznej liczby 90 egzaminów (po 3 egzaminy na każdy 30 przedmiotów). Liczba przedmiotów, które można badać, jest ograniczona dostępnością tomografu MR do badań naukowych (1 dzień w tygodniu) i złożonością badań. Podstawowe analizy biochemiczne będą przeprowadzane w sposób ciągły, ale wszystkie próbki od każdego pacjenta (w sumie 30) będą przechowywane w temperaturze -80°C i analizowane jednocześnie.

Część B: Przygotowanie protokołów badań i zapisów dietetycznych, które można wykorzystać do ilościowego określenia spożycia fruktozy. Wyszukiwanie i selekcja tematów.

2025: Część A: Przegląd przedmiotów, egzaminy studyjne – min. Przeprowadzonych zostanie 30 całodniowych badań. Kontynuacja analiz biochemicznych.

Część B: Badania przesiewowe pacjentów (osobnicy ze stłuszczeniem wątroby badani w Części A mogą być również uwzględnieni w Części B). Eksperymenty z interwencją dietetyczną (ok. n=20) w ok. 10 pacjentów (można prowadzić interwencję 1 pacjenta tygodniowo, łącznie z badaniem MR i całonocną izolacją VLDL w pierwszym i ostatnim dniu interwencji). Analizy biochemiczne.

2026: Część A: Przegląd przedmiotów, egzaminy studyjne – min. Przeprowadzonych zostanie 30 całodniowych badań. Kontynuacja analiz biochemicznych. Rozpoczęcie intensywnej analizy danych.

Część B: Badanie przesiewowe badanych. Eksperymenty dotyczące interwencji dietetycznej (n = 10) u pozostałych osób w pierwszym i ostatnim dniu interwencji. Analizy biochemiczne. Specjalistyczne analizy biochemiczne (np. ELISA dla czynnika wzrostu fibroblastów 19 (FGF-19), wybranych hepatokin lub innych białek, które mogą brać udział w regulacji lipogenezy de novo) i analizy lipidomicznej profilu kwasów tłuszczowych w puli wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) i TG w VLDL. Analiza danych i publikacja wyników.

2027: Część A: Egzaminy studyjne z pozostałych przedmiotów – max. Przeprowadzonych zostanie 10 całodniowych badań. Kontynuacja rutynowych analiz biochemicznych. Specjalistyczne analizy biochemiczne (patrz wyżej). Analiza danych i publikacja wyników.

Część B: Końcowa analiza danych i publikacja wyników.

8. OCZEKIWANE WYNIKI Projekt ten dostarczy nowego spojrzenia na mechanizmy, dzięki którym węglowodany proste wpływają na akumulację tłuszczu w wątrobie. Szczególnie ważne będzie porównanie roli fruktozy i glukozy (które są intensywnie badane, ale nie są wykorzystywane przez populację) z sacharozą, cukrem powszechnie używanym do słodzenia przez całą populację. Ponadto eksperyment z ograniczeniem fruktozy w diecie powinien wykazać, czy taka interwencja może być przydatna w leczeniu stłuszczenia wątroby. Ogólnie rzecz biorąc, obie części projektów powinny dostarczyć wyników, które można będzie wdrożyć w praktycznych zaleceniach dietetycznych i ulepszyć strategie leczenia NAFLD.