El papel de los azúcares en la acumulación de grasas en el hígado (FROGLOSA)

1. INTRODUCCIÓN La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) es actualmente la principal causa de enfermedad hepática crónica, afecta aproximadamente a una cuarta parte de la población mundial y la incidencia de la enfermedad sigue aumentando (doi: 10.1210/endrev/bnz009). La aparición de NAFLD está estrechamente asociada con la obesidad, la resistencia a la insulina y/o la diabetes tipo 2 (doi: 10.7759/cureus.20776). Algunos autores incluso consideran que la EHGNA es una manifestación hepática del síndrome metabólico o incluso el precursor del desarrollo del síndrome metabólico (doi: 10.1016/j.dld.2014.09.020).

   La creciente incidencia de NAFLD se ha atribuido al estilo de vida sedentario, a una ingesta energética inadecuada para el gasto energético y también a una mayor ingesta de carbohidratos simples (azúcares añadidos) y, en concreto, a una mayor ingesta de fructosa (tanto como parte de la molécula de sacarosa como también , especialmente en los Estados Unidos (EE. UU.), como componente del jarabe de maíz rico en fructosa (JMAF)). A lo largo de las últimas décadas, se han presentado varios artículos que han demostrado un vínculo entre el aumento del consumo de azúcares añadidos (especialmente de fructosa) y la pandemia de obesidad y resistencia a la insulina (doi: 10.1097/MOL.0b013e3283613bca, doi: 10.1007/s00394-018-1711-4, doi: 10.1016/j.nut.2013.08.014).

   Sin embargo, metanálisis recientes no han respaldado el papel del aumento de la ingesta de azúcar o fructosa añadidos en el desarrollo de la obesidad, la resistencia a la insulina, el síndrome metabólico y la diabetes tipo 2 (doi: 10.1017/S0954422414000067, doi: 10.1007/s00394-016-1345-3 ). Más bien sugieren que los azúcares añadidos son perjudiciales si se asocian con una ingesta energética insuficientemente aumentada. Incluso se sugirió que el aumento del consumo de fructosa/azúcares añadidos puede ser un marcador de un estilo de vida poco saludable. Por otro lado, no se dispone de tantos datos respecto al papel de los azúcares añadidos y, en concreto, de la fructosa, en el desarrollo del hígado graso.

   Esto puede deberse al hecho de que el metabolismo de la glucosa y la fructosa en el hígado es fundamentalmente diferente (doi: 10.1016/j.jada.2010.06.008, doi: 10.3390/nu9091026, doi: 10.1016/j.clnu.2020.12. 022). A diferencia de la glucosa, que se metaboliza en gran medida en los tejidos extrahepáticos, la mayor parte de la fructosa se absorbe y metaboliza directamente en el hígado. Además, la fosforilación de fructosa a fructosa-1-fosfato catalizada por fructoquinasa/cetohexoquinasa no está bajo ningún control de retroalimentación y da como resultado una producción incontrolada de trioso-3-fosfatos. Estos pueden ingresar a la vía de la gluconeogénesis y usarse aún más para reponer el glucógeno (en estado de agotamiento del glucógeno), pero también pueden proporcionar un sustrato para la lipogénesis de novo (DNL) y, al mismo tiempo, inhibir la oxidación de los ácidos grasos. La fructosa parece ser también un potente activador de la vía reguladora de la proteína de unión a elementos reguladora de carbohidratos (ChREBP) que, junto con la proteína de unión a elementos reguladora de esteroles (SREBP), promueve la DNL en el hígado.

   Es importante destacar que, a pesar de que los ácidos grasos liberados del tejido adiposo son la principal fuente de grasa hepática, la contribución del DNL a la acumulación de grasa hepática aumenta significativamente específicamente en pacientes con NAFLD (doi: 10.1172/JCI23621, doi: 10.1053/j .gastro.2013.11.049).

   Los estudios que analizan el efecto del consumo de fructosa sobre el contenido de grasa hepática (HFC) no han llegado a una conclusión clara. En sujetos sanos, la administración de fructosa en condiciones isocalóricas no parece tener ningún impacto sobre los HFC (doi: 10.1093/ajcn/84.6.1374, doi: 10.1093/ajcn/nqz271). Grasa acumulada en el hígado de sujetos sanos sólo cuando se exponen a una dieta hipercalórica alta en fructosa (doi: 10.3945/ajcn.2008.27336). Por el contrario, los hombres con obesidad abdominal acumularon más grasa en el hígado incluso con una dieta isocalórica alta en fructosa (doi: 10.1111/joim.12632). Curiosamente, en el estudio que comparó una dieta alta en glucosa y alta en fructosa en condiciones iso e hipercalóricas, los hombres con sobrepeso acumularon grasa hepática en el hígado sólo en condiciones hipercalóricas, pero no se encontró diferencia en el efecto sobre los HFC entre la glucosa y la fructosa ( doi: 10.1053/j.gastro.2013.07.012).

2. DATOS PILOTO La glucosa y la fructosa pueden tener diferentes efectos en la acumulación de grasa en el hígado, lo que hemos demostrado en nuestros estudios de cambios agudos de HFC después de la administración de nutrientes (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05 ). En estos estudios desarrollamos e introdujimos una prueba funcional que nos permitió monitorear los cambios agudos en la grasa hepática después de un desafío con una carga alta en grasas y/o carbohidratos simples. En la prueba, los 150 g de grasa se administran a los sujetos al comienzo del experimento, mientras que los carbohidratos (50 g de fructosa o glucosa) se administran cada 2 horas para suprimir eficazmente la lipólisis en el tejido adiposo, como lo documenta la supresión de grasas no esterificadas. concentración de ácidos grasos (NEFA) (doi: 10.1093/ajcn/nqy386). De esta manera podemos limitar el impacto de los ácidos grasos del tejido adiposo sobre la acumulación de grasa hepática y los cambios resultantes deberían explicarse por la contribución de la grasa dietética o DNL.

   Es importante destacar que en este modelo hemos demostrado que 6 horas después del consumo de 150 g de grasa (crema), los HFC aumentan tanto en sujetos sanos no obesos con contenido normal de grasa (doi: 10.1093/ajcn/nqy386) como también en sujetos no obesos. sujetos con hepatosteatosis (doi: 10.26402/jpp.2021.1.05). La grasa del hígado también aumenta cuando se coadministra fructosa con grasa. Por el contrario, la coadministración de glucosa con grasas previene dicho aumento de HFC (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05).

3. JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO Los azúcares añadidos representan más del 12% del aporte energético diario. Su papel en la acumulación de grasa hepática se ha estudiado hasta ahora con glucosa pura o fructosa pura. Sin embargo, en la vida real las personas no consumen glucosa o fructosa pura, sino que consumen fructosa junto con glucosa, ya sea como parte de sacarosa o en jarabe de maíz con alto contenido de fructosa. No está del todo claro cómo responderá el contenido de grasa hepática a la mezcla de ambos azúcares. La pregunta de cómo el consumo simultáneo de ambas hexosas afecta la acumulación de grasa en el hígado puede ser de gran importancia práctica y responder a esta pregunta podría contribuir en gran medida a la modificación de las recomendaciones dietéticas para el tratamiento de NAFLD.

   Es importante destacar que, como no pudimos demostrar la diferencia entre la respuesta de HFC a la administración de glucosa y fructosa en sujetos no obesos ni diabéticos (doi: 10.26402/jpp.2021.1.05), Sería preferible estudiar los efectos agudos de estos tres azúcares sobre los HFC después de su coadministración con una carga rica en grasas.

   La cantidad de estudios documentó claramente los efectos adversos del consumo excesivo de fructosa en la salud metabólica. Por otro lado, si la fructosa daña la salud humana, sería importante saber si la restricción de fructosa tiene algún efecto sobre los HFC. De hecho, la restricción de fructosa condujo a una reducción significativa de la grasa hepática después de 9 días en niños obesos (doi: 10.1053/j.gastro.2017.05.043) y después de 6 semanas en individuos obesos (doi: 10.1093/ajcn/nqaa332). Con base en nuestros resultados anteriores, se puede plantear la hipótesis de que eliminar la fructosa de la dieta y reemplazarla por almidón o glucosa debería suprimir eficazmente el contenido de grasa hepática incluso en unos pocos días.

4. HIPÓTESIS

   Se probarán dos hipótesis principales:

   • El aumento del contenido de grasa hepática después de una carga alta en grasas se ve mitigado por la glucosa, pero no por la fructosa ni la sacarosa (Parte A del proyecto).
   • La restricción de fructosa en la dieta a corto plazo (7 días) da como resultado una disminución del contenido de grasa hepática (Parte B del proyecto)

5. DISEÑO EXPERIMENTAL Parte A El diseño de esta parte del estudio será el mismo que el de nuestros estudios anteriores (doi: 10.1093/ajcn/nqy386, doi: 10.26402/jpp.2021.1.05) excepto que durante cada experimento solo se realizarán dos mediciones del contenido de grasa hepática (HFC) mediante espectroscopia de resonancia magnética (MRS). Los tres exámenes con una duración aproximada de 8 horas se realizarán en cada asignatura del estudio. Primero, el contenido de grasa hepática (HFC) se medirá mediante MRS (30-45 minutos). Luego se insertará la cánula en la vena antecubital y se realizará la primera extracción de sangre. Luego, los sujetos recibirán 460 ml de crema (alta carga de grasa: 150 g de grasa en total) con té de frutas endulzado con 50 g de uno de los azúcares (glucosa/fructosa/sacarosa). Dos y cuatro horas después recibirán nuevamente té de frutas endulzado con el mismo azúcar que en el momento 0 h. Luego se extraerá la sangre para análisis bioquímicos a las 0,5, 1, 2 (antes del té), 2,5, 3, 4 (antes del té), 4,5, 5 y 6 horas. Durante el día, los sujetos no recibirán ningún alimento y solo se les permitirá beber agua o té de frutas. La medición del contenido de grasa hepática se repetirá a las 6 horas. Durante el examen de resonancia magnética (RM), también se medirá el volumen de grasa visceral y se determinará la composición corporal. El orden de los exámenes será aleatorio y se realizarán en al menos intervalos de dos semanas.

   Sujetos: En esta parte del proyecto se estudiarán dos grupos de voluntarios varones: 15 sujetos no obesos (índice de masa corporal (IMC) <30 kg/m2) y 15 sujetos obesos (IMC ˃ 30 kg/m2). Los sujetos tendrán entre 18 y 70 años y los grupos estarán emparejados por edades. Según nuestros estudios previos con sujetos masculinos sanos, el número de 13 sujetos en un grupo debería ser suficiente para detectar un incremento del 10 ± 10% en HFC después de la carga de grasa en α = 0,05 (prueba t pareada de dos colas) y β = 0,10 . El número ligeramente mayor por grupo cubre los riesgos asociados con la exclusión o retiro de algunos sujetos durante el estudio.

   Los criterios de exclusión para ambos grupos serán diabetes mellitus (glucosa en ayunas superior a 7 mmol/l, glucosa a las 2 horas tras oGTT ˃ 11,1 mmol/l, o tratamiento antidiabético) u otras enfermedades graves (enfermedades cardiovasculares, cáncer, etc.), alcohol consumo ˃ 30 g/día, intolerancia a la fructosa, uso de fármacos que afectan el metabolismo de los lípidos e intolerancia a la resonancia magnética (claustrofobia, implantes metálicos, etc.). Antes del ingreso al estudio, los sujetos firmarán los consentimientos informados con participación en el estudio y pruebas genéticas y antes de cada experimento firmarán el consentimiento informado con examen de RM.

   Parte B Los sujetos seleccionados para esta parte del estudio primero completarán un registro dietético detallado de tres días que nos permitirá cuantificar su consumo de fructosa, entre otras cosas. Luego se les instruirá detalladamente cómo cambiar su dieta para eliminar la fructosa y recibirán estas recomendaciones también por escrito. El primer día de la intervención dietética de siete días, se les extraerá sangre en ayunas y luego se medirá el contenido de grasa hepática mediante MRS. Posteriormente recibirán un paquete de glucosa y alimentos seleccionados sin fructosa para complementar su dieta. Luego seguirán durante siete días la dieta sin fructosa y llevarán un registro dietético detallado. El último día de la intervención, se les extraerá sangre en ayunas y se les volverá a medir el HFC mediante MRS (después de 168 horas exactamente).

   Sujetos: Se incluirán en el estudio quince sujetos de 18 a 70 años. De manera similar a como en la Parte A, ese número de sujetos es ligeramente superior a 13, un número suficiente para detectar una disminución del 10 ± 10 % en HFC con α = 0,05 (prueba t pareada de dos colas) y β = 0,10.

   Para ser incluido, el contenido de grasa hepática en los sujetos debe ser superior al 6,2% e inferior al 16,5%, lo que corresponde a esteatosis grado 2 (doi: 10.1007/s10334-011-0264-9). Los participantes de la Parte A del estudio que cumplan este criterio también pueden incluirse en la Parte B. Los criterios de exclusión serán los mismos que en la Parte A. Antes de ingresar al estudio, los sujetos firmarán los consentimientos informados con participación en el estudio y pruebas genéticas y antes de cada experimento firmarán el consentimiento informado con examen de RM.

6. MÉTODOS Espectroscopia de RM (MRS). Se utilizará una secuencia estándar de espectroscopía de vóxel único con retención de la respiración (sistema de resonancia magnética (MR) VIDA Siemens de 3 Tesla equipado con una bobina corporal de superficie multicanal) para medir el contenido de grasa hepática (HFC). Se utilizarán imágenes de resonancia magnética en tres orientaciones anatómicas para establecer el volumen de interés de 40x30x25 mm. Se realizará la corrección de las intensidades de la señal para la relajación T2.

   Para obtener información sobre el perfil lipídico de los triglicéridos (TG) hepáticos, se analizarán los espectros MRS como se describió anteriormente (doi: 10.3390/metabo11090625.).

   Imágenes HISTO MR (MRI). Las imágenes de la fracción de grasa con densidad de protones (PDFF) se medirán mediante el protocolo HISTO Siemens aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA). Incluye secuencias espectroscópicas, Dixon y multieco Dixon.

   Evaluación de datos. Los espectros de RM se evaluarán utilizando el LCModel (doi: 10.1002/nbm.698) y el porcentaje de HFC evaluado por MRS se calculará según Longo (doi: 10.1002/jmri.1880050311).

   Medición del contenido de grasa visceral mediante resonancia magnética. El contenido de grasa visceral se medirá mediante una secuencia de eco de espín turbo antes o después de la medición del PDFF. Para evaluar el volumen de grasa visceral y subcutánea se utilizará un software escrito en MATLAB. Para reducir el impacto del operador, dos expertos independientes evaluarán las áreas de grasa visceral.

   Composición corporal. La composición corporal durante la evaluación se determinará mediante InBody.

   Análisis bioquímico. La sangre se recogerá en tubos que contienen todos los inhibidores necesarios, se colocará inmediatamente en hielo y se centrifugará para recoger plasma en 15 minutos. En todas las muestras obtenidas en el estudio se medirán glucosa, triglicéridos (TG), ácidos grasos no esterificados (NEFA), insulina y β-hidroxibutirato. Todos los métodos bioquímicos, de radioinmunoensayo (RIA) y de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) necesarios para la determinación de estos parámetros se utilizan actualmente en los laboratorios de los solicitantes.

   Lipidómica. Las VLDL se aislarán mediante ultracentrifugación y el análisis del perfil de ácidos grasos de los triglicéridos de VLDL y los ácidos grasos libres plasmáticos se llevará a cabo mediante cromatografía líquida - espectrometría de masas (LC-MS) en el departamento de Metabolómica del Instituto de Fisiología de la Academia Checa de Ciencias (servicio pago).

   Genética. Se determinarán los polimorfismos de genes (PNPLA, TM6SF2 y otros) que se sabe que afectan la acumulación de grasa en el hígado.

   Estadística. El análisis y las correlaciones de datos estadísticos se realizarán con el software PRISM 9.1 o JMP.

7. CALENDARIO DEL PROYECTO 2024: Parte A: Preparación de protocolos de estudio, búsqueda y selección de sujetos, inicio de los exámenes del estudio en las primeras materias: se llevarán a cabo aproximadamente 20 exámenes de un día completo de 90 exámenes en total (3 exámenes por cada uno de 30 sujetos). El número de temas que se pueden estudiar está limitado por la disponibilidad de tomógrafos de resonancia magnética para estudios de investigación (1 día a la semana) y la complejidad de los exámenes. Los análisis bioquímicos básicos se llevarán a cabo de forma continua, pero todas las muestras de cada sujeto (30 en total) se almacenarán a -80 ° C y se analizarán simultáneamente.

Parte B: Elaboración de protocolos de estudio y registros dietéticos que puedan utilizarse para la cuantificación del consumo de fructosa. Búsqueda y cribado de temas.

2025: Parte A: Selección de materias, exámenes de estudio - mín. Se realizarán 30 exámenes de una jornada completa. Continuación de los análisis bioquímicos.

Parte B: Selección de sujetos (los sujetos con hepatosteatosis estudiados en la Parte A también pueden incluirse en la Parte B). Experimentos de intervención dietética (aprox. n=20) en aprox. 10 sujetos (se puede intervenir 1 sujeto por semana, incluido examen de resonancia magnética y aislamiento nocturno de VLDL el primer y último día de intervención). Análisis bioquímicos.

2026: Parte A: Selección de materias, exámenes de estudio - mín. Se realizarán 30 exámenes de una jornada completa. Continuación de los análisis bioquímicos. Inicio del análisis intensivo de datos.

Parte B: Selección de sujetos. Experimentos de intervención dietética (n = 10) en los sujetos restantes el primer y último día de intervención. Análisis bioquímicos. Análisis bioquímicos especializados (por ejemplo, ELISA para el factor de crecimiento de fibroblastos 19 (FGF-19), hepatoquinas seleccionadas u otras proteínas que pueden participar en la regulación de la lipogénesis de novo) y análisis lipidómico del perfil de ácidos grasos en el conjunto de ácidos grasos libres (FFA) y TG en VLDL. Análisis de los datos y publicación de resultados.

2027: Parte A: Exámenes de estudio en las materias restantes - máx. Se realizarán 10 exámenes de una jornada completa. Continuación de los análisis bioquímicos de rutina. Análisis bioquímicos especializados (ver arriba). Análisis de los datos y publicación de resultados.

Parte B: Análisis final de los datos y publicación de resultados.

8. RESULTADOS ESPERADOS Este proyecto proporcionará nuevos conocimientos sobre los mecanismos por los cuales los carbohidratos simples afectan la acumulación de grasa en el hígado. De particular importancia será la comparación del papel de la fructosa y la glucosa (que se estudian intensamente pero no son utilizadas por la población) y el de la sacarosa, el azúcar que generalmente utiliza toda la población para endulzar. Además, el experimento con la restricción de fructosa en la dieta debería determinar si dicha intervención puede ser útil para el tratamiento de la hepatosteatosis. En general, ambas partes de los proyectos deberían proporcionar resultados que puedan implementarse en recomendaciones dietéticas prácticas y mejorar las estrategias para el manejo de NAFLD.