参加者のデータと生物脊柱を収集して、ヘルペス帯状疱疹のある人の血管性認知症リスクの増加を媒介する病原性エキソソームを分析する研究。 (R01)

血管認知症：血管性認知症は、アルツハイマー病後の認知症の2番目に一般的な形態であり、脳への血液供給の喪失と脳萎縮と認知障害につながる血液脳関門（BBB）の妥協の喪失として広く特徴付けられています。 （血栓症）は、血管認知症の発症の貢献者と危険因子です。 最近、ウイルスは潜在的な危険因子として特定されています。

水cell帯状疱疹ウイルス（VZV）および血管機能障害：VZVは、水cell（チキン）を産生する人間の二本鎖Alphaherpesvirusのみを採用し、Agpopnading and in nucppsivsig and nuspisting and agisting and in nusosuncususususususususususususususususususの95％を> 95％> 95％in> 95％in感覚および自律神経節の神経節ニューロン30-35内に確立します。ヘルペス帯状疱疹（Hz;帯状疱疹）およびその他の神経疾患の有無にかかわらず生産する3人に少なくとも1人 2つのHzワクチンが利用可能にもかかわらず、毎年100万人以上のアメリカ人がHzを発症します。 一般の人々にはあまり知られていないのは、発疹なしのVZV再活性化の頻度です（Zoster Sine Herpete）。 VZVは、神経軸全体にわたって神経節ニューロンから反応することを考えると、基本的に血管系を含むすべての臓器と組織は、特徴的で診断されたHz発疹のない感染と疾患を起こしやすい。 実際、発疹のあるHzの1例ごとに、7人が対応する発疹なしにVZVと再活性化すると予測されています。 さらに、私たちのグループは、個人のサブセットが発疹がないにもかかわらず継続的な複製を持っている可能性があることを示唆して、HZ後12年後の唾液中の活動性ウイルスを依然として排出できることを示しています。この研究では、患者の67％がラッシュ後少なくとも3か月間、唾液中に依然として活動性ウイルスを持っていました40 したがって、VZV疾患の負担、特に期間は、ひどく過小評価されている可能性があります。

Hzは脳卒中の危険因子として認識されています。 Hzは、産後1年後に脳卒中のリスクを増加させ、眼科分布または40歳未満の個人でHzが発生するとリスクが高くなります。41 具体的には、米国、ヨーロッパ、アジアの9つの研究からプールされたデータは、Hz後の脳卒中の相対的なリスクが1.78（95％CI 1.70-1.88）であることを示しています。 Hz後の最初の1か月間、徐々に1.20（95％CI 1.14-1.26）に低下します 1年後。41 Hz Ophthalmicusエピソードの後の最初の月に脳卒中のリスクはより大きなマージンで増加しました：相対リスクは2.05（95％CI 1.82-2.31）でした。 そして、脳卒中のリスクは、急性エピソードの1年後に上昇したままでした。 41 23,339 Hzの個人と46,378のコントロールに関する最近の米国遡及的研究で、調査官は、8週間の総合期間中、Hzの個人が脳卒中に苦しむ可能性が有意に高いことを発見しました：18〜49歳のすべての患者と患者の調整済み発生率比率は1.40（95％CI、0.93-2.11） 8.12（95％CI、0.93-71.27）、 それぞれ（p <0.05）;リスクは1年までにベースラインに戻りました42 すべてのHZの個人と比較して、50歳未満のHZの個人の脳卒中リスクの増加は、これらの個人がHZワクチンの資格がないため、注目に値します。

VZVおよび血管疾患の根底にあるメカニズムは完全には解明されていませんが、VZVに感染した動脈の組織学的および免疫組織化学研究、サイトカインおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMPS）のVZV血管障害患者の脳脊髄液（CSF）の分析（CSF）は、MMPS（MMPS）を提供します（MMPS）。 Bubak、2018）10。 具体的には、VZVの再活性化時に、ウイルスは、ウイルスに感染した外来線維芽細胞が疾患の初期に関与する堅牢な炎症反応を誘発し、T細胞とマクロファージが疾患全体で堅牢な炎症反応を引き出す動脈の最も外側の臨床層で終わる神経繊維に沿って移動します。 VZV感染細胞、好中球、およびその他の浸潤免疫細胞は活性化されたMMPを産生し、細胞外マトリックスを分解し、血管壁の弱体化、動脈瘤形成、破裂を引き起こします。 炎症細胞によって分泌される可溶性因子は、肥厚した内膜における血管平滑筋の死と筋線維芽細胞の蓄積にさらに寄与するように報告されており、動脈閉塞を引き起こす可能性があります。 ただし、「可溶性因子」は、最近まで私たちのグループによって特徴付けられていません（以下で説明）。

病気のエキソソームの役割状態：循環エキソソームは、原産地から遠く離れた細胞に影響を与える可能性のある重要な「可溶性要因」として浮上しています。 エキソソームは、貨物（タンパク質、核酸など）を運ぶエンドソーム起源の小さな細胞外小胞（直径で〜40-200 nm）です。正常状態および病理学的状態の間のコミュニケーションのために、由来の細胞から隣接するまたは遠位細胞になります。 たとえば、血小板、巨核球、および末梢血単核細胞（PBMC）に由来するエキソソームは、CXCR4およびCCR5をこれらの受容体を欠く細胞に移し、それによってHIV感染の感受性細胞の数を増やすことができます。 他の研究では、EBVに陽性の鼻咽頭癌細胞から放出されたエキソソームには、ウイルス性潜在膜タンパク質1および腫瘍微小環境を操作して腫瘍の進行を促進し、腫瘍細胞に対する免疫応答を緩和する他のウイルス/細胞因子が含まれています。 さらに、エキソソーム（およびその他の細胞外小胞）から派生した：

1. 乳がん細胞は血小板の活性化と凝集を誘発し、癌関連血栓症に寄与する51;そして
2. VZV感染原発性ヒト脳血管血管抗源線維芽細胞は、内皮細胞の機能不全とビリオンの伝達を媒介します。 最近、急性Hzの患者からの病原性血漿エキソソームがプロスボンティックおよび炎症誘発性であることを示すパイロット研究を発表しました。 Hzエキソソームで有意に上昇し、血小板の活性化、シグナル伝達、および凝集経路に関与した特定のタンパク質には、Thrombospondin 1（THBS1）、53,54 Caveolae関連タンパク質2（Cavin-2）、55凝固因子V（F5）、56および凝固因子XIII A1鎖57（F13A1）が含まれます。 Hzエキソソームで上昇した心血管系疾患タンパク質には、カルモジュリン1（calm1）およびトランスサイレチン（TTR）が含まれていました（図1）。 カルモジュリン1の上昇は、低酸素虚血性脳損傷後の神経細胞死に関連する酸化ストレスに寄与する可能性があり、脳卒中転帰不良の予測因子です。58,59 血清トランスシレチンの増加は虚血性脳卒中転帰の改善と関連していますが、60トランスシレチンは酸化ストレス、炎症、細胞毒性をオリゴマー化して誘導することもできます。61,62 実際、Hzの間、アミロイド促進因子は血漿に存在し、8は脳のアミロイド血管障害（CAA）を呼び起こす動脈の循環トランスシレチンの増加の凝集を引き起こす可能性があります。

血管認知症とVZVの間のリンク：上記のように、VZVは前述のリスク要因（脳卒中、血管炎症など）の原因剤であることが示されています。 さらに、2つの独立したデータベース（FinngenとUKB）からの最近の疫学研究では、VZVの再活性化により、特に血管性認知症を発症するリスクが大幅に増加しました（それぞれ2.33および6.22;ハザード比）。 血管性認知症およびアルツハイマー病の発症に対する一般的なVZVおよびウイルスの受け入れの障壁は、死亡時の病気の組織におけるウイルス抗原/核酸の欠如または一貫性のない存在です。 これは、「ヒットアンドラン」現象（ウイルス感染組織に感染し、不可逆的な損傷を引き起こしますが、その後クリアされます）によって潜在的に説明される可能性がありますが、末梢（背側根および三叉神経節）で生成される非感染性エキソソームはウイルス複製部位から遠い病気に寄与する可能性があることを提案します。 VZVが溶解感染症の非存在下で血管性認知症の病理に直接貢献するメカニズムは研究されておらず、この提案の焦点です。 まとめると、HZおよびその後数か月間に循環するエキソソームが血管炎と血栓症を促進するため、血管機能障害リスクの増加に先行する血管機能障害リスクの増加の機構的基礎を提供すると仮定します。

重要性：血管疾患やアルツハイマー病を含むVZVと認知症を結びつける強力な疫学的および相関データが存在します。13,15-20 しかし、機械的証拠の不足により、この2つを原因的にリンクするのをためらうことができました。 したがって、この提案は、血管疾患プロセスでHzに続く病原性の長期にわたるエキソソームの役割を体系的にテストすることにより、知識のこのギャップに対処することを目的としています。 機械的に発見する関心のあるタンパク質/miRNAは、抗ウイルス療法の期間とHZの抗植物誘発剤の使用に関して臨床診療を潜在的に変化させるとともに、発疹および緩和脳卒中および血管性認知症のリスクを防ぐためのワクチン接種のサポートを増加させる可能性があります。 さらに、我々の発見は、他の病原体が感染の領域から遠く離れた部位で長期にわたる効果をもたらす方法のモデルとして役立ち、病原体関連エキソソームの生物学的結果に関するさらなる研究を刺激します。

イノベーションと影響：この提案には、いくつかのイノベーション分野があります。 Hzおよび12か月のポスト中の循環エキソソームの縦方向の特性評価と機構的調査は次のとおりです。

1. Hz後の血管性認知症および脳卒中の疫学的に観察されたリスクの増加に機械的理解を提供します。 血管性認知症やアルツハイマー病を含む認知症へのウイルスの直接的な寄与は、2つをリンクするほとんどのデータが疫学的および相関があることを考えると、依然として議論の余地があります。 この提案で生成されたデータは、VZVが血管疾患に直接つながる方法に関する偏りのない機械的情報を提供し、初期段階の危険因子またはその欠如の非常に必要な原因証拠を提供します。
2. 臨床管理を変更します。 現在、修飾可能な脳卒中および血管疾患の危険因子には、高血圧、喫煙、糖尿病、高コレステロール血症が含まれます。 これらの病原性エキソソームは血栓症と血管炎のリスクを増加させるため、脳卒中のリスク因子の修飾には、非整形サブユニットワクチン（Shingrix）によるHzワクチン接種が含まれる必要があります。 Hzが発生した場合、これらの病原性エキソソームと抗炎症剤と抗炎症剤だけでなく、これらの病原性エキソソームが持続する時間を示す結果によって決定されるように、より長い持続時間抗ウイルス療法が決定される場合があります。 利用可能な場合は、エキソソームの放出/融合を防ぐ新しい治療薬の使用もあります。
3. 感染症のパラダイムを変えます。 通常、感染剤の臨床的特徴が解決されると（VZV再活性化による発疹など）、その後の人間の健康への影響は無視できると想定しています。 トリガーする感染剤の非存在下で数ヶ月間循環する病原性エキソソームの存在は、臨床医が脳卒中または血管疾患の症状から遠く離れている感染症を考慮する必要があることを示唆しています。
4. 単一のエキソソームの並べ替えと特性評価を可能にする新しい最先端のテクノロジー（Exoview R200）を採用して、人口の不均一性を理解するのに役立ちます。 これらの結果は、2つの目的（エキソソームシーケンスデータを含む）の結果のより大きな結果とともに、将来の助成金のデータを提供して、エキソソームサブセットの起源の関数とセルを解明します。

研究の根拠の目的1。12か月間にわたって一致したコントロールとHzの個人からの既知の血管損傷タンパク質/miRNAのエキソソーム含有量を分析します。 質量分析と小型RNA配列決定を使用して、血管機能障害、炎症、凝固、および脳卒中に関連するエキソソームタンパク質およびmiRNAの存在量と時間的変化を定量化し、その後、分析物を臨床および実験室の特徴と相関させます（抗VZV IGGチーターおよびIGM、IGM、包括的なメタブパネル）。 濃縮分析は、エキソソームタンパク質とmiRNAのネットワークで実施され、Hz、血管機能障害、および神経変性プロセスに関連する経路と共有分析物を発見します。

理論的根拠：急性Hzの間に、血漿エキソソームにはTHBS1および血管機能障害に関連する他のタンパク質が含まれていることを最近公開しました。 しかし、これらの危険因子タンパク質の縦方向の持続性は知られておらず、抗ウイルス治療を超えた長期の血管認知症リスクと最終的に標的となる介入療法を媒介するメカニズムを明らかにするために不可欠です。 HZの再活性化と5年以内の認知症診断の増加を相関させる疫学的データを考えると、15年以内に認知症診断が増加し、最近ではHZ再活性化と血管認知症リスクの強い相関関係を考えると、13は特定の危険因子タンパク質とMIRNAがHZ再活性化後1年間まで上昇し続けると予測します。 危険因子タンパク質の時間的ダイナミクスは、急性時点を超えた重要なステップです。なぜなら、通常、発疹クリアランスに続く個人はもはや抗ウイルス療法ではなく、その拡張は臨床的に実行可能で費用対効果の高いリスクを減らす方法であることが証明されるからです。

目的2。非感染性Hzエキソソームが血管機能障害を促進するメカニズムを決定します。 上記の時点でコントロールおよびHzの個体から分離された血漿エキソソームは、APOE4対立遺伝子を持つ健康なドナーまたはドナーに由来するヒト血管内皮細胞に適用され、炎症性サイトカイン（IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-6、IL-8、IL-8、IL-8、IL-8、IL-8、IL-8、IL-2、 IL-13、およびTNF-α）が多重ELISAによる。 細胞は、活性酸素種（ROS）生成とアミロイド沈着についても分析されます。 さらに、以下の定量化により血小板機能を評価するために、健康なドナーから血小板をコントロールおよびHzエキソソームに曝露します。 （2）マイクロ流体フローアッセイにおける血小板接着と凝集。 （3）血栓収縮アッセイによる血小板収縮。 次に、HZ後12か月までの個人の脳卒中およびその他の血管イベントの開発を含む、機能的アッセイの結果を臨床およびラボの特徴（上記）と相関させます。 Thrombospondin-1などの特定のタンパク質のノックダウン実験を実施して、分子レベルでの病因のメカニズムを調査します。

理論的根拠：我々は、血管の認知症、すなわち脳血管妊娠線維芽細胞（HBVAF）、血管内皮細胞（VEC）、および血小板に不可欠な3つの細胞タイプに対するHzエキソソームの病原性効果を調査することを提案します。 そうすることで、VZV誘発性認知症のリスクの上昇の疫学的証拠の根底にあるメカニズムを明らかにすることを目指しています。 第一に、HBVAFは、反応性酸素種（ROS）とサイトカイン、76の生産、およびVZV血管障害症例中の外来症の増殖と移動を通じて、血管疾患と機能障害に重要な役割を果たすことが知られています。 我々の予備研究は、HZ後3か月で採取されたHZ血漿エキソソームにさらされたHBVAFが、炎症と血管壁の構造と機能の重要な調節因子であるIL-6とIL-8の分泌を誘導することを示しました。 しかし、この効果、他のサイトカイン、およびROS産生の期間は解明されておらず、HZ後12か月の個人に見られる慢性血管機能障害に基本的な役割を果たす可能性があります。 第二に、VECは、血管性認知症の症例で観察された血管機能障害の重要な成分でもあり、ROS産生および炎症誘発性サイトカイン放出の増加、および血液脳帯の完全性を媒介する緊密な接合部の破壊です。 さらに、APOE4対立遺伝子を運ぶ個人は、VECを発現するAPOE4が他のAPOEアイソフォームと比較して炎症誘発性およびプロトンボーティック状態の高さを示すため、血管性認知症を発症するリスクが高くなります。67-69。 したがって、APOE4のキャリアと非キャリアの両方に由来するVECを比較することにより、Hzエキソソームの病原性効果が個人を運ぶAPOE4で悪化するかどうかを調査することを提案します。 最後に、血管性認知症は、脳への血流の閉塞によって特徴付けられ、患者で血小板多動性が観察されます。 私たちの以前の研究では、急性Hz中のHzエキソソームが血小板の活性化と血小板白血球凝集を誘導したことが明らかになりました。 ただし、この効果の持続時間は不明であり、臨床的に使用された抗血小板剤の有無にかかわらず、HZ後12か月までテストされます。 Hzエキソソームが血小板の活性化に及ぼす長期にわたる影響の発見と、対応する抗血小板薬の緩和効果は、臨床的に実行可能な治療介入を表す可能性があります。

以前の報告では、マクロファージにさらされた場合のエキソソームにおけるTHBS1の炎症誘発性の役割について説明しています。 私たちのパイロット研究と予備データは、Hz患者のエキソソームでTHSB1の堅牢な増加を示していますが、コントロールしていません。 したがって、HzエキソソームのTHBS1の上昇がサイトカイン放出とROS産生の増加の原因であるかどうかをテストするために、THBS1阻害剤LSKLの存在下および非存在下でHBVAFおよびVEC暴露実験を実施します。 さらに、THBS1はTGFB1の強力な活性化因子であり、TGFB1の過剰生産はアルツハイマー病および血管疾患で観察され、脳血管アミロイドーシスを誘導します。79-81 したがって、THBS1阻害剤は、血管細胞におけるエキソソーム媒介性THBS1を介したアミロイド形成を評価するために、アミロイド沈着アッセイにも使用されます。

研究デザインこの研究は、対照群と比較して12か月間のHz個人の既知の血管損傷タンパク質/miRNAのエキソソーム含有量を分析するために参加者データと生物脊柱を収集する非介入/観察研究です。

AIM1。12か月間にわたって、一致したコントロールとHzの個人からの既知の血管損傷タンパク質/miRNAのエキソソーム含有量を分析します。

予想される結果と解釈：予備的および公開されたパイロット研究結果に基づいて、血栓症および血管疾患（「危険因子タンパク質」）に関連するエキソソームタンパク質の有意な増加を測定することを期待しています。 さらに、患者が抗ウイルス療法を受けていたため、HZ個人のこれらのエキソソームタンパク質は、最初の訪問中および7日後に同様のレベルにとどまると予想しています。その後、1か月と3か月で、抗ウイルス剤で単に遅くなった継続的なウイルス複製をまだ持っている個人のサブセットのこれらのタンパク質の増加が予想されます。これらの個人は、最初の訪問以来減少しなかったVZV IgG力価（VZV IgG力価の減少は、生産的なVZV感染の分解能と潜時に戻るウイルスを反映しています）、最初の訪問以来のVZV IgGTERSの上昇、または持続性VZV IGMまたはVZV IGMの否定から陽性への変換。 言い換えれば、VZV IgGレベルは、Hz個人のサブセットにおける関心のあるタンパク質のこれらの上昇に対応し、特定の患者で発疹のない継続的なウイルス複製を示唆していると予測しています。 実際、私たちのグループは以前、発疹の存在なしにHzの3か月から12年後のHz個人の67％の唾液におけるVZVの持続的な脱落を報告しています。 したがって、Hz個体のエキソソーム危険因子タンパク質の上昇は、ウイルスの不完全なシャットダウンによるものである可能性があります。 これらの危険因子タンパク質は、Hz後約3か月でピークに達し、Hz後6か月と12か月で減少すると予想されます。これは、VZV血管障害の個人の研究がHzから脳卒中までの平均時間が約4か月であることを示したためです。 さらに、脳卒中リスクがHZOの個人で最も高いことを考えると、HZO個人のエキソソームは、すべてのHz個人の中で最高レベルの危険因子タンパク質を持つことを期待しています。 私たちの予備研究で予測されているように、コントロールおよびHzの個人のエキソソームにウイルスタンパク質またはサイトカインを見つけることは期待していません。

HzエキソソームのRNA配列決定に関しては、VZV DNAとRNAがHz（Personal Communications、教授、Ravi Mahalingam教授）中にはめったに検出されないため、ウイルス転写産物が表示されるとは考えていません。 血管疾患のある人で上昇するmiR-221やmiR-222などの脳および心血管疾患に関係するmiRNAの変化を検出すると予想されます。 興味深いことに、私たちの研究室での予備研究では、モック感染ニューロンのエキソソームと比較して、VZV感染感覚ニューロンのエキソソームにおけるこれらのmiRNAの有意な上昇が示されました（図2）。 最後に、APOE4を運ぶAPOE4は、APOE4を考慮して、循環エキソソームで最も堅牢で持続的な危険因子タンパク質/miRNAが血管性認知症の既知の危険因子であると予想しています。67-69

目的2。非感染性Hzエキソソームが血管機能障害を促進するメカニズムを決定します。

予想される結果と解釈：私たちのパイロットサイトカイン研究では、コントロールと比較したHzエキソソームへの暴露後のHBVAFS（これは炎症と血管壁の構造と機能の重要な調節因子）からのIL-6およびIL-8の産生の増加を示しました（図3）。 これは、サンプルサイズが大きくなり、VECSで発生する場合に引き続き当てはまると予測しています。 これらのサイトカインとROSの生産は、1か月と3か月の時点でピークに達すると仮定します。 ほとんどの人にとって、ナイーブ細胞に炎症とROSを誘導する能力がHz後12か月で減少すると仮定しますが、VECを運ぶAPOE4は過炎症のままである可​​能性があります。 また、in vitroでモックまたはVZVに感染したヒト感覚ニューロンに由来するエキソソームを使用して、このアッセイを実施しました。 模擬エキソソームと比較して、ナイーブHBVAFに適用されるVZV条件のエキソソーム（非感染性）は、IL-6、IL-8、およびIL-1βの分泌を大幅に増加させました。したがって、炎症性サイトカイン産生を引き起こすエキソソームは、VZV感染細胞に由来すると思われます。 リスク因子タンパク質の上昇を含むHzエキソソームの長期上昇が見られることを考えると、これらのHzエキソソームは、HZ2後3か月でIL-6とIL-8を誘導する可能性があります。 上記のように、私たちのグループは、発疹のクリアランスから最大12年までHz患者の唾液で活発なVZV脱落を示しました。 また、Hzエキソソームにさらされた細胞でのアミロイド沈着が観察されると予測しますが、コントロールではなく、この効果はVECを運ぶAPOE4で最も顕著であると予測します。 最後に、免疫蛍光染色は、血液脳帯バリアの完全性の破壊を示すHz曝露VECのタイトジャンクション染色の減少を示す可能性があります。 病原性プロセスは、HzエキソソームのTHBS1の負荷の上昇によるものであり、THBS1の活性をブロックすることがこれらの効果を減衰させると考えられています。

私たちのパイロット研究に基づいて、2は、Hzエキソソームへの曝露後にP-セレクチンとホスファチジルセリンを発現する血小板の増加によって測定されるように、血小板活性化の増加を見ることを予想していますが、エキソソームをコントロールしません。 さらに、この活性化パターンは、疫学データと一致して、脳卒中の持続的なリスクを示す3か月の時点で依然として顕著であると予測しています。 Hzサンプルからの20％のエキソソーム曝露は、10％よりも顕著な活性化パターンを持つ可能性があります。 Hz後12か月の活性化パターンは減少し、対照エキソソームと有意な違いはないと予想されます。 同様に、コントロールエキソソームにさらされた血小板と比較してHzエキソソームにさらされた血小板のマイクロ流体モデルにおける血小板およびフィブリンの蓄積の速度と量の増加が見られると予想されます。 CD36阻害剤は、血小板機能に対するHzエキソソーム誘発効果を減衰させると予想されます。これは、強力な機械的証拠を提供します。 複数の方法論を使用して血小板の活性化、凝集、および機能をテストし、HBVAFおよびVECSによる炎症誘発性サイトカイン、ROS、およびアミロイド産生の誘導を使用して、疾患全体のさまざまな時期にHzエキソソームの包括的な機能プロファイルを生成します。 これらの研究の結果は、臨床診療と、一般的なVZVの再活性化についてどう考えるかに重大な意味を持ちます。 具体的には、Hzエキソソームが病理学的に活性であることが示されており、脳卒中および血管機能障害の機能的な増加リスクを付与する場合、予備データが示唆するように、より長い抗ウイルス治療および/または抗血小板療法が保証されます。 最後に、AIM 2で提案されている機能的/機械的アッセイと相関する質量分析（AIM 1）を介してエキソソームの特定のタンパク質を特定する可能性があります。