Een studie die gegevens van deelnemers en biospecimens verzamelt om pathogene exosomen te analyseren die een verhoogd risico op vasculaire dementie bemiddelen bij personen met herpes zoster. (R01)

Vasculaire dementie: vasculaire dementie is de tweede meest voorkomende vorm van dementie na de ziekte van Alzheimer en wordt breed gekenmerkt als een verlies van bloedtoevoer voor de hersenen en gecompromitteerde bloed-hersenbarrière (BBB) ​​die uiteindelijk leidt tot hersensatrofie en cognitieve plattelmoezie). zijn bijdragers en risicofactoren voor de ontwikkeling van vasculaire dementie. Onlangs zijn virussen geïdentificeerd als potentiële risicofactoren.

Varicella Zoster-virus (VZV) en vasculaire disfunctie: VZV is een exclusief humaan, dubbelstrengs DNA alphaherpesvirus dat varicella produceert (chaippox) en vervolgens latentie in sensorische en autonome ganglionische neurons30-35 in> 95% van de Amerikaanse 36,37 met verouderende en immunosuppressie, Vzv-reacteren, vzv in ten minste 1 in ten minste 1 in de Amerikaanse volwassenen in de VS. 3 individuen om herpes zoster (Hz; gordelroos) en andere neurologische ziekten te produceren met of zonder uitslag.38 Ondanks de beschikbaarheid van twee Hz -vaccins, ontwikkelen meer dan 1 miljoen Amerikanen jaarlijks Hz.9 Minder bekend bij het grote publiek is de frequentie van VZV -reactivering zonder uitslag (zoster sine herpete). Gezien het feit dat VZV reactiveert van ganglionische neuronen over de hele neuraxis, zijn in wezen alle organen en weefsels, inclusief het vaatstelsel, vatbaar voor infectie en ziekte zonder de karakteristieke en diagnostische Hz -uitslag. In feite wordt voorspeld dat voor elke 1 geval van Hz met uitslag, 7 personen opnieuw zullen activeren met VZV zonder overeenkomstige uitslag.39 Bovendien heeft onze groep aangetoond dat individuen nog steeds een actief virus kunnen afwerpen in hun speeksel tot 12 jaar na Hz, wat suggereert dat ten minste een subset van individuen doorlopende replicatie kan hebben ondanks geen uitslag; In deze studie had 67% van de patiënten nog steeds een actief virus in hun speeksel ten minste 3 maanden na de rash.40 Aldus wordt de last van de VZV -ziekte, met name duur, waarschijnlijk grof onderschat.

Hz wordt erkend als een beroerte -risicofactor; Hz verhoogt het risico op een beroerte tot 1 jaar na Hz, met risico hoger wanneer Hz optreedt in de oogheelkundige verdeling of bij individuen <40 jaar oud.41 In het bijzonder blijkt gegevens uit 9 studies in de VS, Europa en Azië dat het relatieve risico voor een beroerte na Hz 1,78 was (95% BI 1,70-1,88) Voor de eerste maand na Hz daalt, geleidelijk naar 1,20 (95% BI 1.14-1.26) Na 1 jaar.41 Risico op een beroerte nam toe met een grotere marge tijdens de eerste maand na een Hz Ophthalmicus-aflevering: het relatieve risico was 2,05 (95% BI 1,82-2,31); En het beroerte risico bleef een jaar na de acute aflevering verhoogd. 41 Een recente Amerikaanse retrospectieve studie van 23.339 Hz-individuen en 46.378 controles, onderzoekers ontdekten dat Hz-personen gedurende de geaggregeerde periode van 8 weken aanzienlijk meer kans hadden op een beroerte: aangepaste incidentiesnelheidsverhoudingen voor alle patiënten en patiënten van 18 tot 49 jaar waren 1,40 (95% CI, 0,93-2,11) en 8.12 (95% BI, 0,93-71,27), respectievelijk (p <0,05); Risico geretourneerd naar de basislijn na 1 jaar.42 Het verhoogde beroerte risico bij personen met Hz die <50 jaar oud zijn, vergeleken met alle Hz -individuen, is opmerkelijk omdat deze personen niet in aanmerking komen voor het HZ -vaccin.

While the mechanisms underlying VZV and vascular disease are not fully elucidated, histological and immunohistochemical studies of VZV-infected arteries, analysis of cerebrospinal fluid (CSF) from VZV vasculopathy patients for cytokines and matrix metalloproteinases (MMPs), and in vitro studies provide some clues to the pathogenesis of disease (reviewed in Nagel and Bubak, 2018) 10. In het bijzonder, bij VZV-reactivering, reist virus zich langs zenuwvezels die eindigen in de buitenste adventitiële laag van de slagader waar virus-geïnfecteerde adventitiale fibroblasten een robuuste ontstekingsreactie opwekken waarbij neutrofielen vroeg in ziekte betrokken zijn en T-cellen en macrofagen door de hele loop van de ziekte. VZV-geïnfecteerde cellen, neutrofielen en andere infiltrerende immuuncellen produceren geactiveerde MMP's, die de extracellulaire matrix afbreken die mogelijk leidt tot verzwakking van de vaatwand, de vorming van aneurysma en breuk. Oplosbare factoren die worden uitgescheiden door inflammatoire cellen zijn ook beschreven om verder bij te dragen aan de dood van vasculaire gladde spierdood en accumulatie van myofibroblasten in de verdikte intima, wat mogelijk leidt tot arteriële occlusie. De "oplosbare factoren" zijn echter tot voor kort niet gekenmerkt door onze groep (hieronder beschreven).

De rol van exosomen in ziektetoestanden: Circulerende exosomen zijn naar voren gekomen als belangrijke "oplosbare factoren" die cellen van hun plaats van herkomst kunnen beïnvloeden. Exosomen zijn kleine extracellulaire blaasjes (~ 40-200 nm in diameter) van endosomale oorsprong die lading (eiwitten, nucleïnezuren, enz.) Van hun cellen van oorsprong tot aangrenzende of distale cellen voor communicatie tijdens normale en pathologische toestanden dragen, reguleren van biologische processen en respons op ziekte.43 Exosomen zijn bijvoorbeeld afgeleid van bloedplaatjes, megakaryocyten en perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) kunnen CXCR4 en CCR5 overbrengen naar cellen die deze receptoren missen, waardoor het aantal gevoelige cellen voor HIV -infectie wordt verhoogd. 44,45 In andere studies bevatten exosomen die worden afgegeven uit nasofaryngeale carcinoomcellen positief voor EBV het virale latente membraaneiwit 1 en andere virale/cellulaire factoren die de tumormicro-omgeving manipuleren om de tumorprogressie te verbeteren en immuunresponsen te verlichten naar tumorcellen.46-50 Verder zijn exosomen (en andere extracellulaire blaasjes) afgeleid van:

1. Borstkankercellen induceren activering en aggregatie van bloedplaatjes, wat bijdraagt ​​aan kanker-geassocieerde trombose51; En
2. VZV-geïnfecteerde primaire menselijke hersenen vasculaire adventitiële fibroblasten mediëren endotheliale celdisfunctie en transmissie van virions.52 We hebben onlangs een pilotstudie gepubliceerd met pathogene plasma -exosomen van patiënten met acute Hz zijn protrombotisch en pro -inflammatoir.2 Specifieke eiwitten die significant waren verhoogd in Hz-exosomen en betrokken waren bij de activering, signalering en aggregatieroutes van bloedplaatjes omvatten trombospondine 1 (THBS1), 53,54 Caveolae-geassocieerd eiwit 2 (Cavin-2), 55 Coagulatiefactor V (F5), 56 en coagulatiefactor XIII A1-keten (F13A1) 57 (Fig. 1). Cardiovasculair systeemziekte -eiwitten verheven in Hz -exosomen omvatten calmoduline 1 (Calm1) en transphyretine (TTR) (Fig. 1). Verhoogde calmoduline 1 kan bijdragen aan oxidatieve stress geassocieerd met neurale celdood na hypoxisch-ischemisch hersenletsel en is een voorspeller van slechte beroerte-uitkomsten.58,59 Hoewel verhoogde serumtransthyretine is geassocieerd met verbeterde uitkomsten van ischemische beroertes, kunnen 60 transphyretine ook oligomeriseren en oxidatieve stress, ontsteking en celtoxiciteit induceren.61,62 Tijdens Hz zijn amyloïde-promoterende factoren inderdaad aanwezig in plasma, 8 veroorzaken mogelijk mogelijk aggregatie van verhoogde circulerende transporteren tot de toxische oligomere vorm in slagaders die doen denken aan cerebrale amyloïde angiopathie (CAA).

Verbinding tussen vasculaire dementie en VZV: zoals hierboven beschreven, is aangetoond dat VZV een oorzakelijk middel is van de bovengenoemde risicofactoren (beroerte, vasculaire ontsteking, enz.). Bovendien bleek uit een recent epidemiologisch onderzoek uit twee onafhankelijke databases (FinnGen en UKB) dat VZV -reactivering het risico op het ontwikkelen van vasculaire dementie in het bijzonder aanzienlijk verhoogt (respectievelijk 2.33 en 6.22; hazard ratio's) .13 Een barrière bij de acceptatie van VZV en virussen in het algemeen voor de ontwikkeling van vasculaire dementie en de ziekte van Alzheimer is het gebrek aan of inconsistente aanwezigheid van virusantigeen/nucleïnezuren in de zieke weefsels op het moment van overlijden. Hoewel dit mogelijk kan worden verklaard door een "hit-and-run" fenomeen (virus infecteert weefsels, veroorzaakt onomkeerbare schade maar wordt vervolgens opgeruimd), stellen we voor dat niet-infectieuze exosomen geproduceerd in de periferie (dorsale wortel en trigeminale ganglia) kunnen bijdragen aan de ziekte van de ziekte van virale replicatie. De mechanismen waarin VZV direct bijdraagt ​​aan vasculaire dementie -pathologie in afwezigheid van een lytische infectie is niet bestudeerd en is de focus van dit voorstel. Al met al veronderstellen we dat circulerende exosomen tijdens Hz en in de daaropvolgende maanden vasculitis en trombose zullen bevorderen, waardoor een mechanistische basis biedt voor het verhoogde vasculaire disfunctierisico voorafgaand aan vasculaire dementie.

Significantie: sterke epidemiologische en correlationele gegevens bestaan ​​die VZV en dementie koppelen, inclusief vaatziekten en de ziekte van Alzheimer.13,15-20 Een schaarste aan mechanistisch bewijs heeft echter ertoe geleid dat een aarzeling om de twee te verbinden. Dit voorstel heeft dus tot doel deze kloof in kennis aan te pakken door de rol van pathogene, langdurige exosomen na Hz op vasculaire ziekteprocessen systematisch te testen. Mechanistisch blootleggen van eiwitten/miRNA's van interesse kunnen mogelijk de klinische praktijk veranderen met betrekking tot de duur van antivirale therapie en het gebruik van anti-platletteletmiddelen voor Hz, evenals de ondersteuning voor vaccinatie te vergroten om uitslag te voorkomen en het risico op een beroerte en vasculair dementie te voorkomen. Bovendien zullen onze bevindingen dienen als een model voor hoe andere ziekteverwekkers langdurige effecten kunnen hebben op locaties op afstand van infectiegebieden en verder onderzoek naar de biologische gevolgen van pathogeen-geassocieerde exosomen stimuleren.

Innovatie en impact: dit voorstel heeft verschillende gebieden van innovatie. De longitudinale karakterisering en mechanistisch onderzoek van circulerende exosomen tijdens Hz en 12 maanden post zal:

1. Zorg voor een mechanistisch begrip voor de epidemiologisch waargenomen verhoogde risico op vasculaire dementie en beroerte na Hz. De directe bijdragen van virussen aan dementie, waaronder vasculaire dementie en de ziekte van Alzheimer, zijn nog steeds controversieel gezien de meeste gegevens die de twee koppelen, epidemiologisch en correlationeel zijn. Gegevens die in dit voorstel worden gegenereerd, zullen onbevooroordeelde mechanistische informatie bieden over hoe VZV rechtstreeks kan leiden tot vaatziekten, wat bijdraagt ​​aan de broodnodige oorzakelijk oorzakelijk bewijs van een in een vroeg stadium risicofactor of gebrek daaraan.
2. Verander klinisch beheer. Momenteel omvatten risicofactoren met een gewijzigbare beroerte en vaatziekten hypertensie, roken, diabetes en hypercholesterolemie. Omdat deze pathogene exosomen het risico op trombose en vasculitis verhogen, moet de aanpassing van de beroerte risicofactor Hz-vaccinatie omvatten met het niet-live subeenheidvaccin (Shingrix). Als Hz optreedt, kan antivirale therapie met langere duur gerechtvaardigd zijn zoals bepaald door onze resultaten die de tijdsduur aantonen die deze pathogene exosomen aanhouden, evenals anti-platlettelet en anti-ontstekingsmiddelen. Indien beschikbaar, kan er ook een gebruik zijn voor nieuwe therapeutica die exosoomafgifte/fusie voorkomen.
3. Verander het paradigma van infectieziekten. Meestal gaan we ervan uit dat zodra de klinische kenmerken van een besmettelijk agent zijn opgelost (zoals uitslag van VZV -reactivering), de daaropvolgende impact ervan op de gezondheid van de mens te verwaarlozen is. De aanwezigheid van pathogene exosomen die maandenlang circuleren in afwezigheid van het triggerende besmettelijke middel suggereert dat artsen van het tijdstip van een beroerte of vaatziekten een infectieuze geschiedenis moeten overwegen.
4. Gebruik nieuwe, geavanceerde technologie (EXOVIEW R200) ​​die het sorteren en karakterisering van afzonderlijke exosomen mogelijk maakt om ons te helpen de heterogeniteit van de bevolking te begrijpen. Deze resultaten, samen met de grotere hoeveelheid resultaten van de 2 doelen (inclusief exosoomsequencinggegevens), zullen gegevens verstrekken voor toekomstige subsidies om de functie en cellen van oorsprong van de exosoomsubsets op te helderen.

Studierationele doel 1. Analyseer exosoomgehalte voor bekende vasculaire schadelijke eiwitten/miRNA's van gematchte controle- en Hz-individuen gedurende een periode van 12 maanden. Using mass spectrometry and small RNA sequencing, we will quantify abundance and temporal changes of exosomal proteins and miRNAs associated with vascular dysfunction, inflammation, coagulation, and stroke, then correlate analytes with clinical and laboratory features (anti-VZV IgG titers and IgM, complete blood counts, comprehensive metabolic panel, and aPTT/PT/INR). Verrijkingsanalyses zullen worden uitgevoerd op het netwerk van exosomale eiwitten en miRNA's om routes en gedeelde analyten geassocieerd met Hz, vasculaire disfunctie en neurodegeneratieve processen te ontdekken.

Rationale: we hebben onlangs gepubliceerd dat tijdens acute Hz, plasma -exosomen verhoogde THBS1 en andere eiwitten geassocieerd met vasculaire disfunctie.2 De longitudinale persistentie van deze risicofactor-eiwitten is echter niet bekend en is noodzakelijk voor het ontdekken van de mechanismen die langetermijnvasculaire dementie-risico's bemiddelen en uiteindelijk gerichte interventietherapieën voorbij antivirale behandelingen. Gezien de epidemiologische gegevens die Hz -reactivering en een toename van de diagnose van de dementie binnen 5 jaar, 15 en meer recentelijk correleren, zal de sterke correlatie van Hz -reactivering en vasculair dementie -risico, 13 we voorspellen bepaalde risicofactor -eiwitten en miRNA's blijven verhoogd tot een jaar na Hz -reactivering. Tijdelijke dynamiek van de risicofactor-eiwitten is een cruciale stap verder dan acute tijdstippen omdat, doorgaans, na overhaaste klaring personen niet langer op antivirale therapie zijn, waarvan de uitbreiding een klinisch haalbare en kosteneffectieve manier zou kunnen zijn om het risico te verminderen.

Doel 2. Bepaal het mechanisme (en) waarin niet-infectieuze Hz-exosomen vasculaire disfunctie bevorderen. Plasma exosomes isolated from control and HZ individuals at timepoints above will be applied to human vascular endothelial cells derived from healthy donors or donors with APOE4 allele, then conditioned supernatant analyzed for proinflammatory cytokines (IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13 en TNF-a) door multiplex elisa. Cellen zullen ook worden geanalyseerd op het genereren van reactieve zuurstofspecies (ROS) en amyloïde depositie. Bovendien zullen we bloedplaatjes van gezonde donoren blootstellen aan controle en Hz-exosomen om de bloedplaatjesfunctie te beoordelen door kwantificering van: (1) bloedplaatjesactivatie (opregulatie van p-selectine, αIIBβ3 en fosfatidylserine) door flowcytometrie; (2) bloedplaatjesadhesie en aggregatie in microfluïdische stroombepalingen; en (3) retractie van bloedplaatjes door stolselcontractie assays. We zullen dan functionele testresultaten correleren met klinische en laboratoriumkenmerken (hierboven), inclusief de ontwikkeling van beroerte en andere vasculaire gebeurtenissen bij de individuen tot 12 maanden na Hz. Knock-down experimenten van specifieke eiwitten zoals trombospondine-1 zullen worden uitgevoerd om het mechanisme van pathogenese op moleculair niveau te onderzoeken.

Rationale: we stellen voor om de pathogene effecten van Hz -exosomen op drie celtypen te onderzoeken die integraal zijn met vasculaire dementie, namelijk hersenvasculaire adventitiële fibroblasten (HBVAF's), vasculaire endotheelcellen (VEC's) en bloedplaatjes. Door dit te doen, willen we de mechanismen ontdekken die ten grondslag liggen aan het epidemiologische bewijs van VZV-geïnduceerd verhoogd risico op vasculaire dementie. Ten eerste is bekend dat HBVAF's een sleutelrol spelen bij vaatziekten en disfunctie, door de productie van reactieve zuurstofspecies (ROS) en cytokines, 76 evenals proliferatie en migratie van het adventitia tijdens VZV vasculopathie gevallen.10.10 Onze voorlopige studie toonde aan dat HBVAF's blootgesteld aan Hz-plasma-exosomen die werden genomen bij 3 maanden na Hz de secretie van IL-6 en IL-8 induceerden, die belangrijke regulatoren zijn van ontsteking en vasculaire wandstructuur en -functie, vergeleken met controle-plasma-exosomen.2 De duur van dit effect, andere cytokines en ROS-productie zijn echter niet opgehelderd en kunnen een fundamentele rol spelen in chronische vasculaire disfunctie die tot 12 maanden na Hz bij individuen wordt gezien. Ten tweede zijn VEC's ook belangrijke componenten in vasculaire disfunctie waargenomen in gevallen van vasculaire dementie, met een toename van de ROS-productie en pro-inflammatoire cytokine-afgifte, evenals een verstoring van strakke juncties die de integriteit van de bloed-hersenbarier bemiddelen. Bovendien hebben ApoE4-allel die individuen draagt ​​een verhoogd risico op het ontwikkelen van vasculaire dementie, 67-69 als ApoE4 die VEC's tot expressie brengt, vertonen een verhoogde pro-inflammatoire en protrombotische toestand in vergelijking met andere ApoE-isovormen.77 Daarom stellen we voor om te onderzoeken of de pathogene effecten van Hz-exosomen worden verergerd bij APOE4 die individuen draagt, door VEC's te vergelijken die zijn afgeleid van zowel een drager als niet-drager van APOE4. Ten slotte wordt vasculaire dementie gekenmerkt door een occlusie van bloedstroom naar de hersenen, met bloedplaatjeshyperactiviteit waargenomen bij patiënten. Onze vorige studie onthulde dat Hz-exosomen tijdens acute Hz-activering van bloedplaatjes en bloedplaatjes-leukocytenaggregaties induceerden. De duur van dit effect is echter onbekend en zal worden getest tot 12 maanden na Hz, met en zonder klinisch gebruikte anti-bloedplaatjes. De bevinding van een langdurige impact van Hz-exosoom op de activering van bloedplaatjes en overeenkomstige verzachtende effect van anti-platletteletgeneesmiddelen kan een klinisch haalbare therapeutische interventie vertegenwoordigen.

Eerdere rapporten hebben een pro-inflammatoire rol beschreven voor THBS1 in exosomen bij blootstelling aan macrofagen.78 Onze pilotstudie en voorlopige gegevens tonen een robuuste toename van THSB1 bij exosomen van Hz -patiënten maar geen controle. Daarom, om te testen of de verhoogde belasting van THBS1 in Hz -exosomen verantwoordelijk is voor de toename van cytokine -afgifte en ROS -productie, zullen we de HBVAF- en VEC -blootstellingsexperimenten uitvoeren in de aanwezigheid en afwezigheid van een THBS1 -remmer, LSKL. Verder is THBS1 een krachtige activator van TGFB1 en overproductie van TGFB1 wordt waargenomen bij de Alzheimer en vaatziekten en induceert cerebrovasculaire amyloïdose.79-81 Daarom zal de THBS1-remmer ook worden gebruikt in de amyloïde afzettingsbepalingen om exosoomdragende, THBS1-gemedieerde amyloïde vorming in vasculaire cellen te evalueren.

Studieontwerp Deze studie is een niet-interventioneel/observationeel onderzoek dat gegevens van deelnemers en biospecimens verzamelt om het exosoomgehalte te analyseren voor bekende vasculaire schadelijke eiwitten/miRNA's bij Hz-individuen gedurende een periode van 12 maanden (6 bezoeken) vergeleken met controlegroep (één bezoek).

Doel 1. Analyseer exosoomgehalte voor bekende vasculaire schadelijke eiwitten/miRNA's van gematchte controle- en Hz-individuen gedurende een periode van 12 maanden.

Verwachte resultaten en interpretaties: op basis van onze voorlopige en gepubliceerde pilotstudieresultaten verwachten we een significante toename van exosoomeiwitten te meten geassocieerd met trombose en vasculaire aandoeningen ("Risicofactor-eiwitten") inclusief THBS1, Cavin-2, F5, F13A1, Calm1, Calm1, Calm1, Calm1, Calm1, Calm1 en Transthyretin (TTR) in plasma-exosomen verkrijgbare Hz-individuen (initiële bezoekers). Verder verwachten we dat deze exosomale eiwitten bij Hz -individuen tijdens het eerste bezoek op vergelijkbare niveaus blijven en 7 dagen later omdat patiënten antivirale therapie zouden hebben gehad; Vervolgens verwachten we na 1 en 3 maanden een toename van deze eiwitten in een subset van personen die nog steeds voortdurende virale replicatie hebben die alleen werd vertraagd met antivirale middelen; Deze personen zouden VZV IgG -titers hebben die sinds het eerste bezoek niet daalden (afnemende VZV IgG -titers weerspiegelen productieve VZV -infectie -oplossing en virus die terugkeert naar latentie), stijgende VZV IgG -titers sinds het eerste bezoek, of aanhoudende VZV IGM of conversie van VZV IGM van negatief naar positief. Met andere woorden, we voorspellen dat de VZV IgG -niveaus zullen overeenkomen met deze verhogingen in de interessante eiwitten in een subset van Hz -individuen, wat suggereert dat bij bepaalde patiënten voortdurende virale replicatie suggereert. Onze groep heeft inderdaad eerder de aanhoudende afval van VZV gemeld in het speeksel van 67% van de Hz -individuen van 3 maanden tot 12 jaar na Hz zonder de aanwezigheid van een uitslag.56 Aldus kunnen de verhogingen van exosomale risicofactor -eiwitten bij Hz -individuen te wijten zijn aan de onvolledige sluiting van het virus. We verwachten dat deze risicofactor-eiwitten op ongeveer 3 maanden na Hz zullen pieken, en dan afnemen na 6- en 12 maanden na Hz omdat een studie van VZV-vasculopathie individuen de gemiddelde tijd van Hz tot een beroerte toonde, is ongeveer 4 maanden.57 Bovendien, gezien het feit dat het beroerte -risico het hoogst is voor personen met HZO, verwachten we dat exosomen van HZO -individuen het hoogste niveau van risicofactor -eiwitten hebben bij alle Hz -individuen. Zoals voorspeld in onze voorlopige studies, verwachten we niet dat we virale eiwitten of cytokines vinden in de exosomen van controle- en Hz -individuen.

Met betrekking tot RNA -sequencing van Hz -exosomen verwachten we geen virale transcripten omdat VZV -DNA en RNA zelden worden gedetecteerd tijdens Hz (persoonlijke communicatie, professor Ravi Mahalingam). We verwachten veranderingen te detecteren in miRNA's die betrokken zijn bij cerebro- en hart- en vaatziekten zoals miR-221 en miR-222 die zijn verhoogd bij personen met vaatziekten, 73 miR-143, een belangrijke mediator van longarteriële hypertensie, 74 en miR-31 die oxidatieve stress in vasculaire spiercellen is. Interessant is dat een voorlopig onderzoek in ons laboratorium de significante verhoging van deze miRNA's in exosomen van door VZV geïnfecteerde sensorische neuronen in vergelijking met exosomen uit met spots geïnfecteerde neuronen (Fig. 2) toonde. Ten slotte verwachten we dat APOE4 die individuen vervoert de meest robuuste en aanhoudende risicofactor-eiwitten/miRNA's in hun circulerende exosomen te hebben gezien APOE4 is een bekende risicofactor voor vasculaire dementie.67-69

Doel 2. Bepaal het mechanisme (en) waarin niet-infectieuze Hz-exosomen vasculaire disfunctie bevorderen.

Verwachte resultaten en interpretaties: onze pilootcytokinestudies toonden een toename van de productie van IL-6 en IL-8 van HBVAF's (die belangrijke regulatoren zijn van ontsteking en vasculaire wandstructuur en functie) na blootstelling aan Hz-exosomen vergeleken met controles (Fig. 3) .2 We voorspellen dat dit het geval zal blijven met een grotere steekproefomvang en in de VEC's optreden. We veronderstellen deze cytokines en de ROS-productie zal een piek bij de periode van 1 en 3 maanden zullen pieken. Voor de meeste individuen veronderstellen we het vermogen om ontstekingen te induceren en ROS in naïeve cellen zal afnemen met 12 maanden na Hz, maar APOE4 die VEC's draagt ​​zal waarschijnlijk hyper-inflammatoire blijven. We hebben deze test ook uitgevoerd met behulp van exosomen die zijn afgeleid van mock- of VZV-geïnfecteerde menselijke sensorische neuronen in vitro. Vergeleken met nep-exosomen, verhoogde VZV-geconditioneerde exosomen (die niet-infectieus zijn) toegepast op naïeve HBVAF's de secretie van IL-6, IL-8 en IL-1β aanzienlijk; Daarom vermoeden we dat de exosomen die ontstekingscytokineproductie veroorzaken, afkomstig zijn van VZV-geïnfecteerde cellen. Aangezien we een langdurige verhoging van Hz-exosomen die verhoogde risicofactor-eiwitten bevatten, zien en deze Hz-exosomen nog steeds IL-6 en IL-8 kunnen induceren op 3 maanden na Hz2 suggereert dat er voortdurende virale replicatie is in (een subset of alle) HZ-patiënten goed nadat uitslag is verdwenen. Zoals hierboven opgemerkt, vertoonde onze groep actieve VZV -afstoting in het speeksel van Hz -patiënten tot 12 jaar na klaring van uitslag.40 We voorspellen ook om amyloïde depositie in te observeren in cellen die worden blootgesteld aan Hz -exosomen, maar geen controles en dat dit effect het meest prominent zal zijn in de APOE4 die VEC's draagt. Ten slotte zal immunofluorescerende kleuring waarschijnlijk een vermindering van strakke junctiekleuring in Hz blootgestelde VEC's laten zien die wijzen op een verstoring van de integriteit van bloed-hersenbarier. Wij geloven dat de pathogene processen gedeeltelijk te wijten zijn aan de verhoogde belasting van THBS1 in Hz -exosomen en dat het blokkeren van de activiteit van THBS1 deze effecten zal verzwakken.

Op basis van onze pilotstudie verwachten we een toename van de activering van bloedplaatjes te zien zoals gemeten door een toename van bloedplaatjes die P-selectine en fosfatidylserine tot expressie brengen na blootstelling aan Hz-exosomen maar geen controle-exosomen. Verder voorspellen we dat dit activeringspatroon nog steeds prominent zal zijn op het tijdstip van 3 maanden dat indicatief is voor een langdurig risico op beroerte, consistent met epidemiologische gegevens; De blootstelling van 20% exosoom van Hz -monsters heeft waarschijnlijk een meer uitgesproken activeringspatroon dan 10%. We verwachten dat het activeringspatroon na 12 maanden na Hz zal worden verminderd en niet significant verschillend van controle -exosomen. Evenzo verwachten we een toename van de snelheid en de hoeveelheid ophoping van bloedplaatjes en fibrine te zien in de microfluïdische modellen van bloedplaatjes die worden blootgesteld aan Hz -exosomen in vergelijking met bloedplaatjes die worden blootgesteld aan controle -exosomen. We verwachten dat de CD36-remmer de door Hz exosoom geïnduceerde effecten op de bloedplaatjesfunctie zal verzwakken, wat sterk mechanistisch bewijs zal opleveren. Met behulp van meerdere methoden om de activering, aggregatie en functie van bloedplaatjes te testen, evenals de inductie van pro -inflammatoire cytokine, ROS en amyloïde productie door HBVAF's en VEC's, zullen we een uitgebreid functioneel profiel genereren voor Hz -exosomen bij verschillende tijdstippen bij verschillende tijd. Resultaten van deze studies zullen kritische implicaties hebben voor de klinische praktijk en hoe we denken aan VZV -reactivering in het algemeen. In het bijzonder, als Hz-exosomen pathologisch actief zijn en een functioneel verhoogd risico op beroerte en vasculaire disfunctie verlenen, zoals onze voorlopige gegevens suggereren, dan zijn een langere antivirale behandeling en/of anti-platelettherapieën gerechtvaardigd. Ten slotte is het waarschijnlijk dat we specifieke eiwitten in de exosomen zullen identificeren via massaspectrometrie (in doel 1) die zullen correleren met de functionele/mechanistische assays voorgesteld in AIM 2. Dit zou verdere therapeutische interventionele doelen en voorlopige gegevens kunnen bieden voor toekomstige knock-down experimenten waar exosomale eiwitten van belang zijn om te kijken of het ploteletactivatie is verzonden.