En studie som samlar in deltagarnas data och biopecimen för att analysera patogena exosomer som förmedlar ökad vaskulär demensrisk hos individer med herpes zoster. (R01)

Vaskulär demens: Vaskulär demens är den näst vanligaste formen av demens efter Alzheimers sjukdom och kännetecknas i stort sett en förlust av blodtillförsel till hjärnan och komprometterade blod-hjärnbarriär (BBB) ​​som slutligen leder till hjärnatrofi och kognitiv nedsättning. Bidragsgivare och riskfaktorer för utveckling av vaskulär demens. Nyligen har virus identifierats som potentiella riskfaktorer.

Varicella zoster virus (VZV) and vascular dysfunction: VZV is an exclusively human, double-stranded DNA alphaherpesvirus that produces varicella (chickenpox) then establishes latency within sensory and autonomic ganglionic neurons30-35 in >95% of adults in the U.S.36,37 With aging and immunosuppression, VZV reactivates in at least 1 av 3 individer för att producera herpes zoster (Hz; bältros) och andra neurologiska sjukdomar med eller utan utslag.38 Trots tillgängligheten av två Hz -vacciner utvecklar mer än 1 miljon amerikaner Hz årligen.9 Mindre som är känd för allmänheten är frekvensen av VZV -återaktivering utan utslag (zoster sinus herpete). Med tanke på att VZV återaktiverar från ganglioniska neuroner över hela neuraxis, är i huvudsak alla organ och vävnader, inklusive vaskulaturen, benägna att infektion och sjukdomar utan det karakteristiska och diagnostiska Hz -utslaget. I själva verket förutsägs det att för varje 1 fall av Hz med utslag kommer 7 individer att återaktivera med VZV utan motsvarande utslag.39 Dessutom har vår grupp visat att individer fortfarande kan tappa aktivt virus i sin saliv upp till 12 år efter Hz som tyder på att åtminstone en delmängd av individer kan ha pågående replikering trots inget utslag; I denna studie hade 67% av patienterna fortfarande aktivt virus i sin saliv minst 3 månader efter utslag.40 Således är bördan av VZV -sjukdom, särskilt varaktighet, sannolikt grovt underskattad.

HZ erkänns som en strokriskfaktor; Hz ökar risken för stroke upp till 1 år efter Hz, med risken högre när Hz inträffar i oftalmisk distribution eller hos individer <40 års ålder.41 Specifikt visar data som samlats från 9 studier i USA, Europa och Asien att den relativa risken för stroke efter Hz var 1,78 (95% CI 1,70-1,88) För den första månaden efter Hz, sjunker gradvis till 1,20 (95% CI 1,14-1,26) Efter 1 år.41 Strokrisken ökade med en större marginal under den första månaden efter en HZ Ophthalmicus-avsnitt: Relativ risk var 2,05 (95% CI 1,82-2,31); och strokrisken förblev förhöjd ett år efter det akuta avsnittet. 41 En ny amerikansk retrospektiv studie av 23 339 Hz-individer och 46 378 kontroller, fann utredarna att under den 8 veckors aggregerade perioden var Hz-individer betydligt mer benägna att drabbas av en stroke: justerade incidensförhållanden för alla patienter och patienter som åldrades 18 till 49 år var 1,40 (95% CI, 0,93-2.11) och 8.12 (95% CI, 0,93-71,27), respektive (p <0,05); Risken återvände till baslinjen med 1 år.42 Den ökade strokrisken hos individer med Hz som är <50 år, jämfört med alla HZ -individer, är anmärkningsvärt eftersom dessa individer inte kvalificerar sig för Hz -vaccinet.

While the mechanisms underlying VZV and vascular disease are not fully elucidated, histological and immunohistochemical studies of VZV-infected arteries, analysis of cerebrospinal fluid (CSF) from VZV vasculopathy patients for cytokines and matrix metalloproteinases (MMPs), and in vitro studies provide some clues to the pathogenesis of disease (reviewed in Nagel and Bubak, 2018) 10. Specifikt, vid VZV-reaktivering, reser virus längs nervfibrer som avslutas i det yttersta adventitiella skiktet av artären där virus-infekterade adventitiella fibroblaster framkallar ett robust inflammatoriskt svar som involverar neutrofiler tidigt vid sjukdom, och T-celler och makrofager under hela kursen. VZV-infekterade celler, neutrofiler och andra infiltrerande immunceller producerar aktiverade MMP: er, vilket försämrar den extracellulära matrisen som potentiellt leder till försvagning av kärlväggen, aneurysmbildning och brott. Lösliga faktorer som utsöndras av inflammatoriska celler har också beskrivits för att ytterligare bidra till vaskulär glatt muskeldöd och ackumulering av myofibroblaster i den förtjockade intima, vilket potentiellt leder till arteriell ocklusion. De "lösliga faktorerna" har emellertid inte karakteriserats förrän nyligen av vår grupp (beskrivs nedan).

Roll av exosomer i sjukdomstillstånd: cirkulerande exosomer har framkommit som viktiga "lösliga faktorer" som kan påverka celler som är avlägsna från deras ursprungsplats. Exosomer är små extracellulära vesiklar (~ 40-200 nm i diameter) av endosomalt ursprung som bär last (proteiner, nukleinsyror, etc.) från deras ursprungsceller till angränsande eller distala celler för kommunikation under normala och patologiska tillstånd, reglerar biologiska processer och svar på sjukdom.4333 Exosomer härrörande från blodplättar, megakaryocyter och perifera blodmononukleära celler (PBMC) kan överföra CXCR4 och CCR5 till celler som saknar dessa receptorer och därmed öka antalet mottagliga celler för HIV -infektion.44,455 I andra studier innehåller exosomer frisatta från nasofaryngeala karcinomceller positiva för EBV det virala latenta membranproteinet 1 och andra virala/cellulära faktorer som manipulerar tumörmikro-miljön för att förbättra tumörprogression och lindra immunsvar mot tumörcell.46-50 Vidare härrörde exosomer (och andra extracellulära vesiklar) från:

1. Bröstcancerceller inducerar blodplättaktivering och aggregering, vilket bidrar till cancerassocierad trombos51; och
2. VZV-infekterad primär mänsklig hjärnvaskulär adventitial fibroblaster förmedlar endotelcelldysfunktion och överföring av virioner.52 Vi har nyligen publicerat en pilotstudie som visar patogena plasmaexosomer från patienter med akut HZ är protrombotiska och proinflammatoriska.2 Specifika proteiner som var signifikant förhöjda i Hz-exosomer och involverade i blodplättaktiverings-, signal- och aggregeringsvägarna inkluderade trombospondin 1 (THBS1), 53,54 Caveolae-associerat protein 2 (CAVIN-2), 55 Koagulationsfaktor V (F5), 56 och koaguleringsfaktor xii A1 kedja (F13A1) 5) 5 (Fig. 1). Kardiovaskulära systemsjukdomsproteiner förhöjda i Hz -exosomer inkluderade calmodulin 1 (CALM1) och transthyretin (TTR) (fig. 1). Förhöjd kalmodulin 1 kan bidra till oxidativ stress förknippad med neuralcelldöd efter hypoxisk ischemisk hjärnskada och är en förutsägare för dåliga stroke resultat.58,59 Även om ökat serumtranthyretin har associerats med förbättrade ischemiska stroke resultat, kan 60 transthyretin också oligomerisera och inducera oxidativ stress, inflammation och celltoxicitet.61,62 Under Hz finns faktiskt amyloidfrämjande faktorer i plasma, vilket potentiellt orsakar aggregering av ökad cirkulerande transthyretin till den toxiska oligomera formen i artärer som påminner om cerebral amyloid angiopati (CAA).

Länk mellan vaskulär demens och VZV: Som beskrivits ovan har VZV visat sig vara ett orsakande medel för ovannämnda riskfaktorer (stroke, vaskulär inflammation etc.). Vidare fann en ny epidemiologisk studie från två oberoende databaser (Finngen och UKB) VZV -reaktivering avsevärt risken för att utveckla vaskulär demens i synnerhet (2,33 respektive 6,22; riskförhållanden) .13 En barriär i acceptans av VZV och virus i allmänhet till utvecklingen av vaskulär demens och Alzheimers sjukdom är bristen eller inkonsekvent närvaro av virusantigen/nukleinsyror i de sjuka vävnaderna vid dödstillfället. Även om detta potentiellt kan förklaras av ett "hit-and-run" -fenomen (virus infekterar vävnader, orsakar irreversibel skada men därefter rensas), föreslår vi att icke-infektiösa exosomer som produceras i periferin (dorsal rot och trigeminal ganglia) kan bidra till sjukdom som är avlägsna från plats för viala replikation. Mekanismerna där VZV direkt bidrar till vaskulär demenspatologi i frånvaro av en lytisk infektion har inte studerats och är i fokus för detta förslag. Sammantaget antar vi att cirkulerande exosomer under Hz och under efterföljande månader kommer att främja vaskulit och trombos, vilket ger en mekanistisk grund för den ökade vaskulära dysfunktionsrisken före vaskulär demens.

Betydelse: Stark epidemiologisk och korrelationsdata finns koppling av VZV och demens, inklusive kärlsjukdom och Alzheimers sjukdom.13,15-20 En brist på mekanistiska bevis har emellertid resulterat i en tveksamhet att kausativt koppla de två. Således syftar detta förslag till att ta itu med detta gap i kunskap genom att systematiskt testa rollen för patogena, långvariga exosomer efter HZ på vaskulära sjukdomsprocesser. Mekanistiskt avslöjande proteiner/miRNA: er av intresse kan potentiellt förändra klinisk praxis när det gäller varaktighet av antiviral terapi och användning av anti-plattaktiga medel för Hz, samt öka stödet för vaccination för att förhindra utslag och mildra stroke och vaskulär demensrisk. Dessutom kommer våra resultat att fungera som en modell för hur andra patogener kan ha långvariga effekter på platser som är avlägsna från regioner av infektion och stimulera ytterligare forskning om de biologiska konsekvenserna av patogenassocierade exosomer.

Innovation och inverkan: Detta förslag har flera innovationsområden. Den longitudinella karaktäriseringen och mekanistisk undersökning av cirkulerande exosomer under Hz och 12-månaders post kommer att:

1. Ge en mekanistisk förståelse för den epidemiologiskt observerade ökade risken för vaskulär demens och stroke efter Hz. De direkta bidrag från virus till demens, inklusive vaskulär demens och Alzheimers sjukdom, är fortfarande kontroversiell med tanke på att de flesta data som kopplar de två är epidemiologiska och korrelationella. Uppgifter som genereras i detta förslag kommer att ge opartisk mekanistisk information om hur VZV direkt kan leda till kärlsjukdom, vilket bidrar med efterfrågade orsakande bevis på en riskfaktor i tidigt skede eller brist på detta.
2. Ändra klinisk hantering. För närvarande inkluderar modifierbar riskfaktorer för stroke och kärlsjukdomar hypertoni, rökning, diabetes och hyperkolesterolemi. Eftersom dessa patogena exosomer ökar risken för trombos och vaskulit, bör modifiering av stroke riskfaktor inkludera Hz-vaccination med det icke-live underenhetsvaccinet (Shingrix). Om Hz inträffar kan antiviral terapi med längre varaktighet vara motiverad som bestäms av våra resultat som visar hur lång tid dessa patogena exosomer kvarstår, såväl som anti-platelet och antiinflammatoriska medel. När det är tillgängligt kan det också användas för nya terapeutika som förhindrar exosomfrisättning/fusion.
3. Ändra paradigmet för infektionssjukdom. Vanligtvis antar vi att när de kliniska egenskaperna hos ett infektiöst medel har lösts (som utslag från VZV -återaktivering) är dess efterföljande påverkan på människors hälsa försumbar. Närvaron av patogena exosomer som cirkulerar i månader i frånvaro av det utlösande infektiösa medlet antyder att kliniker måste överväga infektionshistoria fjärrkontroll från tidpunkten för stroke eller vaskulär sjukdomspresentation.
4. Anställ ny, banbrytande teknik (Exoview R200) ​​som gör det möjligt för sortering och karakterisering av enstaka exosomer att hjälpa oss att förstå befolknings heterogeniteten. Dessa resultat, tillsammans med den större resultaten från de två målen (inklusive exosom -sekvenseringsdata), kommer att tillhandahålla data för framtida bidrag för att belysa funktionen och cellerna för ursprunget för exosomundergrupperna.

Studierationell mål 1. Analysera exosominnehåll för kända vaskulära skadliga proteiner/miRNA från matchade kontroller och Hz-individer under en 12-månadersperiod. Med hjälp av masspektrometri och liten RNA-sekvensering kommer vi att kvantifiera överflöd och temporära förändringar av exosomala proteiner och miRNA associerade med vaskulär dysfunktion, inflammation, koagulering och stroke, sedan korrelera analyser med kliniska och laboratoriefunktioner (anti-VZV IgG-titrar och ig, kompletta blodräkningar, omfattande metaboliska paneler och aption/pt-pt). Anrikningsanalyser kommer att genomföras på nätverket av exosomala proteiner och miRNA för att avslöja vägar och delade analytter associerade med Hz, vaskulär dysfunktion och neurodegenerativa processer.

Motivering: Vi har nyligen publicerat att under akut Hz innehåller plasmaexosomer förhöjda THBS1 och andra proteiner associerade med vaskulär dysfunktion.2 Emellertid är den longitudinella persistensen av dessa riskfaktorproteiner inte känd och är avgörande för att avslöja mekanismerna som förmedlar långvarig vaskulär demensrisk och i slutändan riktade interventionsbehandlingar utöver antivirala behandlingar. Med tanke på den epidemiologiska data som korrelerar Hz -reaktivering och en ökning av demensdiagnos inom 5 år, 15 och mer nyligen, kommer den starka korrelationen mellan Hz -reaktivering och vaskulär demensrisk, 13 Vi förutspår vissa riskfaktorproteiner och miRNA kommer att förbli förhöjda i upp till ett år efter Hz -reaktivering. Temporal dynamik för riskfaktorproteinerna är ett kritiskt steg utöver akuta tidpunkter eftersom, vanligtvis efter utslag av utslag av att individer inte längre är på antiviral terapi, vars förlängning kan visa sig vara ett kliniskt genomförbart och kostnadseffektivt sätt att minska risken.

Mål 2. Bestäm mekanismen i vilka icke-infektiösa Hz-exosomer främjar vaskulär dysfunktion. Plasma exosomes isolated from control and HZ individuals at timepoints above will be applied to human vascular endothelial cells derived from healthy donors or donors with APOE4 allele, then conditioned supernatant analyzed for proinflammatory cytokines (IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13 och TNF-a) av multiplex ELISA. Celler kommer också att analyseras med avseende på reaktiva syrearter (ROS) generering och amyloidavsättning. Dessutom kommer vi att exponera blodplättar från friska givare för kontroll- och Hz-exosomer för att bedöma blodplättfunktionen genom kvantifiering av: (1) blodplättaktivering (uppreglering av P-selektin, aiibp3 och fosfatidylserin) genom flödescytometri; (2) vidhäftning av blodplättar och aggregering i mikrofluidiska flödesanalyser; och (3) trombocytåtertagning genom koagelkontraktionsanalyser. Vi kommer sedan att korrelera funktionella analysresultat med kliniska och labbfunktioner (ovan), inklusive utvecklingen av stroke och andra vaskulära händelser hos individerna upp till 12 månader efter Hz. Knock-down-experiment av specifika proteiner såsom trombospondin-1 kommer att genomföras för att undersöka mekanismen för patogenes på molekylnivå.

Motivering: Vi föreslår att undersöka de patogena effekterna av Hz -exosomer på tre celltyper som är integrerade i vaskulär demens, nämligen hjärnvaskulära adventitiella fibroblaster (HBVAF), vaskulära endotelceller (VEC) och blodplättar. Genom att göra det syftar vi till att avslöja de mekanismer som ligger bakom de epidemiologiska bevisen på VZV-inducerad risk för vaskulär demens. För det första är HBVAFs kända för att spela en nyckelroll vid vaskulär sjukdom och dysfunktion, genom produktion av reaktiva syrearter (ROS) och cytokiner, 76 samt spridning och migration av adventia under VZV -vaskulopati. Vår preliminära studie visade att HBVAF: er exponerade för Hz-plasma-exosomer tagna vid 3-månaders efter Hz inducerade utsöndring av IL-6 och IL-8, som är viktiga regulatorer för inflammation och vaskulär väggstruktur och funktion, jämfört med kontrollplasma-exosomer.2. Varaktigheten på denna effekt, andra cytokiner och ROS-produktion har emellertid inte klargjorts och kan spela en grundläggande roll i kronisk vaskulär dysfunktion som ses hos individer upp till 12 månader efter Hz. För det andra är VEC: er också viktiga komponenter i vaskulär dysfunktion som observerats i vaskulära demensfall, med en ökning av ROS-produktion och proinflammatorisk cytokinfrisättning, samt en störning i trånga korsningar som förmedlar blod-hjärnbarriärintegritet. Dessutom har APOE4-allel som bär individer en förhöjd risk att utveckla vaskulär demens, 67-69 som APOE4 som uttrycker VEC: er uppvisar ett ökat proinflammatoriskt och protrombotiskt tillstånd jämfört med andra ApoE-isoformer.7777777 Därför föreslår vi att undersöka om de patogena effekterna av HZ-exosomer förvärras hos APOE4-bärande individer, genom att jämföra VEC: er härrörande från både en bärare och icke-bärare av APOE4. Slutligen kännetecknas vaskulär demens av en tilltäppning av blodflödet till hjärnan, med blodplätthyperaktivitet som observerats hos patienter. Vår tidigare studie avslöjade att HZ-exosomer under akut Hz inducerade blodplättaktivering och blodplätt-leukocytaggregeringar. Emellertid är varaktigheten för denna effekt okänd och testas ut till 12 månader efter Hz, med och utan kliniskt använda anti-plateletmedel. Upptäckten av en långvarig påverkan av Hz-exosom på blodplättaktivering och motsvarande mildrande effekt av läkemedel mot platta kan representera en kliniskt genomförbar terapeutisk ingripande.

Tidigare rapporter har beskrivit en pro-inflammatorisk roll för THBS1 i exosomer när de utsätts för makrofager.78 Vår pilotstudie och preliminära data visar en robust ökning av THSB1 i exosomer av HZ -patienter men inte kontroller.8 För att testa om den förhöjda belastningen av THBS1 i Hz -exosomer är ansvarig för ökningen av cytokinfrisättning och ROS -produktion, kommer vi att genomföra HBVAF- och VEC -exponeringsexperiment i närvaro och frånvaro av en THBS1 -hämmare, LSKL. Vidare är THBS1 en potent aktivator av TGFB1 och överproduktion av TGFB1 observeras i Alzheimers och vaskulär sjukdom och inducerar cerebrovaskulär amyloidos.79-81 Därför kommer THBS1-hämmaren också att användas i amyloidavlagringsanalyserna för att utvärdera exosombärande, THBS1-medierad amyloidbildning i vaskulära celler.

Studiedesign Denna studie är en icke-interventionell/observationsstudie som samlar in deltagarnas data och biopecimen för att analysera exosominnehåll för kända vaskulära skadliga proteiner/miRNA hos Hz-individer under en 12-månadersperiod (6 besök) jämfört med kontrollgruppen (ett besök).

Mål 1. Analysera exosominnehåll för kända vaskulära skadliga proteiner/miRNA från matchade kontroller och Hz-individer under en 12-månadersperiod.

Anticipated results and interpretations: Based on our preliminary and published pilot study results, we expect to measure a significant increase in exosome proteins associated with thrombosis and vascular disease ("risk factor proteins") including THBS1, CAVIN-2, F5, F13A1, CALM1, and transthyretin (TTR) in plasma exosomes obtained from acute HZ individuals (initial visit) compared to those obtained from controls. Vidare förväntar vi oss att dessa exosomala proteiner hos Hz -individer förblir på liknande nivåer under det första besöket och 7 dagar senare eftersom patienter skulle ha varit på antiviral terapi; Sedan vid 1 och 3 månader förväntar vi oss en ökning av dessa proteiner i en delmängd av individer som fortfarande har pågående viral replikation som bara bromsades med antiviraler; Dessa individer skulle ha VZV IgG -titrar som inte minskade sedan det första besöket (minskande VZV IgG -titrar återspeglar produktiv VZV -infektion som löser sig och virus som återgår till latens), ökande VZV IgG -titrar sedan första besöket, eller ihållande VZV IgM eller omvandling av VZV -IgM från negativa till positiva. Med andra ord förutspår vi att VZV IgG -nivåerna kommer att motsvara dessa höjder i proteinerna av intresse i en delmängd av Hz -individer, vilket antyder pågående viral replikation utan utslag hos vissa patienter. Faktum är att vår grupp tidigare har rapporterat den ihållande utgjutningen av VZV i saliv av 67% av Hz -individer från 3 månader till 12 år efter Hz utan närvaro av ett utslag.56 Således kan höjderna av exosomala riskfaktorproteiner hos Hz -individer bero på ofullständig avstängning av virus. Vi förväntar oss att dessa riskfaktorproteiner kommer att toppa vid ungefär 3 månader efter Hz, och sedan minska vid 6- och 12-månaders efter Hz eftersom en studie av VZV vaskulopati individer visade medeltiden från Hz till stroke är ungefär 4 månader.57 Med tanke på att strokrisken är högst för individer med HZO, förväntar vi oss att exosomer från HZO -individer kommer att ha den högsta nivån av riskfaktorproteiner bland alla HZ -individer. Som förutses i våra preliminära studier förväntar vi oss inte att hitta virala proteiner eller cytokiner i exosomerna av kontroll och Hz -individer.

När det gäller RNA -sekvensering av Hz -exosomer förväntar vi oss inte att se några virala transkript eftersom VZV -DNA och RNA sällan detekteras under Hz (personlig kommunikation, professor Ravi Mahalingam). Vi räknar med att upptäcka förändringar i miRNA: er som är inblandade i cerebro- och hjärt-kärlsjukdom såsom miR-221 och miR-222 som är förhöjda hos individer med kärlsjukdom, 73 miR-143 som är en viktig mediator för lungarteriell hypertoni, 74 och miR-31 som ökar oxidativ stress i vaskulära muskelceller.75 Intressant nog visade en preliminär studie i vårt laboratorium den signifikanta förhöjningen av dessa miRNA i exosomer av VZV-infekterade sensoriska neuroner jämfört med exosomer från håliga infekterade neuroner (fig. 2). Slutligen förväntar vi oss att APOE4 som bär individer ska ha de mest robusta och ihållande riskfaktorproteiner/miRNA i deras cirkulerande exosomer med tanke på APOE4 är en känd riskfaktor för vaskulär demens.67-69

Mål 2. Bestäm mekanismen i vilka icke-infektiösa Hz-exosomer främjar vaskulär dysfunktion.

Förväntade resultat och tolkningar: Våra pilotcytokinstudier visade en ökning av produktionen av IL-6 och IL-8 från HBVAF: er (som är nyckelregulatorer för inflammation och vaskulär väggstruktur och funktion) efter exponering för Hz-exosomer jämfört med kontroller (Fig. 3) .2 .2 Vi förutspår att detta kommer att fortsätta att vara fallet med en större provstorlek och förekommer i VEC: erna. Vi antar att dessa cytokiner och ROS-produktion kommer att toppa vid 1- och 3-månaders tidpunkter. För de flesta individer antar vi förmågan att inducera inflammation och ROS i naiva celler kommer att minska med 12-månaders efter Hz, men APOE4 som bär VEC kommer troligen att förbli hyperinflammatoriska. Vi har också genomfört denna analys med användning av exosomer härrörande från håliga eller VZV-infekterade humana sensoriska neuroner in vitro. Jämfört med håliga exosomer ökade VZV-konditionerade exosomer (som är icke-infektiösa) applicerade på naiva HBVAF: er signifikant utsöndring av IL-6, IL-8 och IL-1p; Därför misstänker vi att exosomerna som utlöser inflammatorisk cytokinproduktion härstammar från VZV-infekterade celler. Med tanke på att vi ser en långvarig höjd av Hz-exosomer som innehåller förhöjda riskfaktorproteiner och dessa Hz-exosomer kan fortfarande inducera IL-6 och IL-8 vid 3 månader efter Hz2 antyder att det finns pågående viral replikering i (en delmängd eller alla) HZ-patienter väl efter att RASH har rensats. Som nämnts ovan visade vår grupp aktiv VZV -utgjutning i salivet hos HZ -patienter upp till 12 år efter clearance av utslag.40 Vi förutspår också att observera amyloidavsättning i celler exponerade för Hz -exosomer men inte kontroller och att denna effekt kommer att vara mest framträdande i APOE4 -bärande VEC. Slutligen kommer immunofluorescerande färgning sannolikt att visa en minskning av tät korsningsfärgning i Hz-exponerade VEC: er som indikerar en störning av blod-hjärnbarriärintegritet. Vi tror att de patogena processerna delvis beror på den förhöjda belastningen av THBS1 i Hz -exosomer och att blockering av THBS1 -aktiviteten kommer att dämpa dessa effekter.

Baserat på vår pilotstudie förväntar vi oss att vi ser en ökning av blodplättaktiveringen mätt med en ökning av blodplättar som uttrycker P-selektin och fosfatidylserin efter exponering för HZ-exosomer men inte kontrollerar exosomer. Vidare förutspår vi att detta aktiveringsmönster fortfarande kommer att vara framträdande vid 3-månaders tidpunkt som indikerar en långvarig risk för stroke, i överensstämmelse med epidemiologiska data; 20% exosomexponering från Hz -prover kommer sannolikt att ha ett mer uttalat aktiveringsmönster än 10%. Vi förväntar oss att aktiveringsmönstret vid 12 månader efter Hz kommer att minskas och inte signifikant skiljer sig från kontrollexosomer. På liknande sätt räknar vi med att se en ökning av hastigheten och mängden blodplättar och fibrinansamling i de mikrofluidiska modellerna av blodplättar exponerade för Hz -exosomer jämfört med blodplättar exponerade för kontrollexosomer. Vi förväntar oss att CD36-hämmaren kommer att dämpa de HZ-exosominducerade effekterna på blodplättfunktionen, vilket kommer att ge starka mekanistiska bevis. Med hjälp av flera metoder för att testa blodplättaktivering, aggregering och funktion, såväl som induktion av proinflammatoriskt cytokin, ROS och amyloidproduktion av HBVAF och VEC, kommer vi att generera en omfattande funktionell profil för HZ -exosomer vid olika tidpunkter under hela sjukdomen. Resultaten från dessa studier kommer att ha kritiska konsekvenser för klinisk praxis och hur vi tänker på VZV -återaktivering i allmänhet. Specifikt, om HZ-exosomer visar sig vara patologiskt aktiva och ger en funktionell ökad risk för stroke och vaskulär dysfunktion, som våra preliminära data antyder, är längre antiviral behandling och/eller anti-platta terapier motiverade. Slutligen är det troligt att vi kommer att identifiera specifika proteiner i exosomerna via masspektrometri (i AIM 1) som kommer att korrelera med de funktionella/mekanistiska analyserna som föreslås i AIM 2. Detta kan ge ytterligare terapeutiska interventionsmål och preliminära data för framtida knock-down-experiment där exosomala proteiner av intresse blockeras för att se om man ser om att se om det är att se om det är att se om det är att se om det är att se om det är att se om det är att se om.