Studie, která shromažďuje data účastníků a biospecimens za účelem analýzy patogenních exosomů, které zprostředkovávají zvýšené riziko vaskulární demence u jedinců s herpesem zoster. (R01)

Vascular dementia: Vascular dementia is the second most common form of dementia after Alzheimer's disease and is characterized broadly as a loss of blood supply to the brain and compromised blood-brain barrier (BBB) ​​ultimately leading to brain atrophy and cognitive impairment.29 Cerebrovascular insults such as stroke, myocardial infarctions, inflammation, and hyperactive platelets (thrombosis) are contributors a rizikové faktory pro vývoj vaskulární demence. Nedávno byly viry identifikovány jako potenciální rizikové faktory.

Virus varicella zoster (VZV) a vaskulární dysfunkce: VZV je výhradně lidský, dvouřetězcový DNA alfaherpesvirus, který produkuje varicella (plané neštovice), poté vytváří latenci v smyslovém a autonomickém ganglionickém neuronech 30-35 v> 95% dospělých v USA36,37 a imunosUpsive, a imunosate. u 3 jedinců produkovat herpes zoster (Hz; šindele) a další neurologická onemocnění s nebo bez vyrážky.38 Navzdory dostupnosti dvou vakcín proti Hz se více než 1 milion Američanů vyvíjí Hz ročně.9 Obecně známou pro širokou veřejnost je frekvence reaktivace VZV bez vyrážky (Zoster Sine Herpete). Vzhledem k tomu, že VZV reaktivuje se z ganglionických neuronů v celé neuraxi, jsou v podstatě všechny orgány a tkáně, včetně vaskulatury, náchylné k infekci a nemoci bez charakteristické a diagnostické vyrážky Hz. Ve skutečnosti se předpokládá, že pro každý 1 případ Hz s vyrážkou bude 7 jedinců reaktivovat s VZV bez odpovídající vyrážky.39 Naše skupina navíc ukázala, že jednotlivci mohou stále prolévat aktivní virus ve svých slinách až do 12 let po Hz, což naznačuje, že alespoň podskupina jednotlivců může mít pokračující replikaci navzdory žádné vyrážce; V této studii mělo 67% pacientů stále ve slinách aktivního viru nejméně 3 měsíce po rase.40 Zasážení onemocnění VZV, zejména doba trvání, je tedy pravděpodobně hrubě podceňována.

Hz je považován za rizikový faktor mrtvice; Hz zvyšuje riziko mrtvice až do 1 roku po Hz, s rizikem vyšší, když se Hz vyskytuje v oftalmické distribuci nebo u jedinců <40 let věku.41 Konkrétně údaje spojené z 9 studií v USA, Evropě a Asii ukazují, že relativní riziko mrtvice po Hz bylo 1,78 (95% CI 1,70-1,88) První měsíc po Hz postupně klesá na 1,20 (95% CI 1,14-1,26) po 1 roce.41 Riziko mrtvice se během prvního měsíce po prvním měsíci po epizodě Hz Ophthalmicus zvýšilo o větší rozpětí: relativní riziko bylo 2,05 (95% CI 1,82-2,31); a riziko mrtvice zůstalo zvýšeno rok po akutní epizodě. 41 Nedávná retrospektivní studie USA s 23 339 Hz jednotlivců a 46 378 kontrol, vyšetřovatelé zjistili, že během 8týdenního agregovaného období byli jednotlivci Hz významně častěji trpí mrtvicí: upravené poměry incidence u všech pacientů a pacientů ve věku 18 až 49 let byly 1,40 (95% CI, 0,93-2,11) a 8,12 (95% CI, 0,93-71,27), respektive (p <0,05); Riziko se vrátilo na základní linii o 1 rok.42 Zvýšené riziko mrtvice u jedinců s Hz, kteří jsou ve věku <50 let, ve srovnání se všemi jednotlivci Hz, je pozoruhodné, protože tito jedinci nemají nárok na vakcínu proti Hz.

While the mechanisms underlying VZV and vascular disease are not fully elucidated, histological and immunohistochemical studies of VZV-infected arteries, analysis of cerebrospinal fluid (CSF) from VZV vasculopathy patients for cytokines and matrix metalloproteinases (MMPs), and in vitro studies provide some clues to the pathogenesis of disease (reviewed in Nagel and Bubak, 2018) 10. Konkrétně, po reaktivaci VZV, virus cestuje podél nervových vláken, která ukončují v nejvzdálenější adventiciální vrstvě tepny, kde virus infikované adventiciální fibroblasty vyvolávají robustní zánětlivou odpověď zahrnující neutrofily brzy u onemocnění a T buňky a makrofágy během celého průběhu onemocnění. VZV infikované buňky, neutrofily a další infiltrující imunitní buňky produkují aktivované MMP, které degradují extracelulární matrici potenciálně vedoucí k oslabení stěny cévy, tvorbě aneuryzmatu a prasknutí. Byly také popsány rozpustné faktory vylučované zánětlivými buňkami, které dále přispívají k smrti vaskulárního hladkého svalstva a akumulaci myofibroblastů v zesílené intimě, což potenciálně vede k arteriální okluzi. „Rozpustné faktory“ však nebyly donedávna charakterizovány naší skupinou (popsáno níže).

Role exosomů ve stavech nemocí: cirkulující exosomy se ukázaly jako důležité „rozpustné faktory“, které mohou ovlivnit buňky vzdálené od jejich místa původu. Exosomy jsou malé extracelulární vezikuly (~ 40-200 nm v průměru) endozomálního původu, které nesou nákladu (proteiny, nukleové kyseliny atd.) Z jejich buněk původu do sousedních nebo distálních buněk pro komunikaci během normálních a patologických stavů, regulace biologických procesů a reakce na onemocnění.43 Například exosomy odvozené z krevních destiček, megakaryocytů a mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) mohou přenést CXCR4 a CCR5 do buněk, které tyto receptory postrádají, a čímž se zvyšuje počet citlivých buněk pro infekci HIV.44,45 V jiných studiích exosomy uvolňované z nasopharyngeálních karcinomových buněk pozitivních na EBV obsahují virový latentní membránový protein 1 a další virové/buněčné faktory, které manipulují s mikroprostředí nádoru, aby se zvýšila progresi nádoru a zmírnila imunitní reakce na nádorové buňky.46-50 Dále, exosomy (a jiné extracelulární vezikuly) odvozené od:

1. Buňky rakoviny prsu indukují aktivaci a agregaci destiček a přispívají k trombóze spojené s rakovinou51; a
2. Primární lidský mozkový vaskulární adveventiální fibroblasty infikované VZV infikované lidským mozkem zprostředkovávají dysfunkci endoteliálních buněk a přenos virionů.52 Nedávno jsme zveřejnili pilotní studii ukazující patogenní plazmatické exosomy od pacientů s akutním Hz jsou protrombotické a prozánětlivé.2 Specific proteins that were significantly elevated in HZ exosomes and involved in the platelet activation, signaling, and aggregation pathways included thrombospondin 1 (THBS1),53,54 caveolae-associated protein 2 (CAVIN-2),55 coagulation factor V (F5),56 and coagulation factor XIII A1 chain (F13A1)57 (Fig. 1). Proteiny onemocnění kardiovaskulárního systému zvýšené v exosomech Hz zahrnovaly kalmodulin 1 (CALL1) a transthyretin (TTR) (obr. 1). Zvýšený kalmodulin 1 může přispět k oxidačnímu stresu spojenému s smrtí nervových buněk po hypoxicky ischemickém mozku a je prediktorem špatných výsledků mrtvice.58,59 Přestože zvýšený sérum transthyretin bylo spojeno se zlepšenými výsledky ischemické mrtvice, 60 transthyretin může také oligomerizovat a indukovat oxidační stres, zánět a buněčnou toxicitu.61,62 Ve skutečnosti během Hz jsou v plazmě přítomny faktory podporující amyloidy, což je 8 potenciálně způsobující agregaci zvýšeného cirkulujícího transtyretinu k toxické oligomerní formě v tepnách připomínajících cerebrální amyloidní angiopatii (CAA).

Spojení mezi vaskulární demencí a VZV: Jak je popsáno výše, ukázalo se, že VZV je původcem výše uvedených rizikových faktorů (mrtvice, vaskulární zánět atd.). Nedávná epidemiologická studie ze dvou nezávislých databází (Finngen a UKB) navíc zjistila, že reaktivace VZV významně zvyšuje riziko vzniku vaskulární demence (2,33 a 6,22; poměry rizik) .13 .13 .13. Bariérou při přijímání VZV a virů obecně k vývoji cévní demence a Alzheimerovy choroby je nedostatečná nebo nekonzistentní přítomnost virových antigenu/nukleových kyselin v nemocných tkáních v době smrti. I když to může být potenciálně vysvětleno fenoménem „hit-and-run“ (virus infikuje tkáně, způsobuje nevratné poškození, ale následně je vyčištěno), navrhujeme, aby neinfekční exozomy produkované na periferii (hřbetní kořen a trigeminální ganglie) přispěly k onemocnění z místa replikace viru. Mechanismy, ve kterých VZV přímo přispívá k patologii vaskulární demence v nepřítomnosti lytické infekce, nebyly studovány a je předmětem tohoto návrhu. Dohromady předpokládáme, že cirkulující exosomy během Hz a v následujících měsících budou podporovat vaskulitidu a trombózu, což poskytne mechanistický základ pro zvýšené riziko vaskulární dysfunkce před vaskulární demencí.

Význam: Existují silné epidemiologické a korelační údaje spojující VZV a demenci, včetně vaskulárního onemocnění a Alzheimerovy choroby.13,15-20 Nedostatečnost mechanistických důkazů však vyústila v váhání s příčinou propojením těchto dvou. Cílem tohoto návrhu je tedy řešit tuto mezeru ve znalostech systematickým testováním role patogenních, dlouhodobých exosomů po Hz na procesech vaskulárních chorob. Mechanisticky odhalující proteiny/miRNA zájmu mohou potenciálně změnit klinickou praxi s ohledem na trvání antivirové terapie a použití anti-destikovacích látek pro Hz a také zvýšit podporu očkování, aby se zabránilo vyrážce a zmírnění mrtvice a rizika vaskulární demence. Naše zjištění budou navíc sloužit jako model toho, jak mohou mít jiné patogeny dlouhodobé účinky v místech vzdálených od oblastí infekce a stimulovat další výzkum biologických důsledků exosomů spojených s patogenem.

Inovace a dopad: Tento návrh má několik oblastí inovací. Longitudinální charakterizace a mechanistické zkoumání cirkulujících exosomů během Hz a 12měsíčního postupu budou:

1. Poskytněte mechanistické porozumění epidemiologicky pozorovanému zvýšenému riziku vaskulární demence a mrtvice po Hz. Přímé příspěvky virů k demenci, včetně vaskulární demence a Alzheimerovy choroby, jsou stále kontroverzní vzhledem k tomu, že většina údajů spojujících dva jsou epidemiologické a korelační. Údaje generované v tomto návrhu poskytnou nezaujaté mechanistické informace o tom, jak může VZV přímo vést k vaskulárním onemocněním, což přispívá tolik potřebným příčinným důkazem o rizikovém faktoru v rané fázi nebo jeho nedostatku.
2. změnit klinické řízení. V současné době patří rizikové faktory modifikovatelných mrtvic a vaskulárních onemocnění hypertenze, kouření, cukrovku a hypercholesterolemii. Protože tyto patogenní exosomy zvyšují riziko trombózy a vaskulitidy, modifikace rizikového faktoru mrtvice by měla zahrnovat očkování proti Hz s vakcínou proti podjednotce (Shingrix). Pokud dojde k HZ, může být zaručena antivirová terapie delší délkou, jak je stanoveno našimi výsledky, které ukazují, že délka času tyto patogenní exosomy přetrvávají, stejně jako anti-vyvážecí a anti-zánětlivá činidla. Pokud je k dispozici, může existovat také použití pro nová terapeutika, která zabraňují uvolnění/fúzi exosomů.
3. Změňte paradigma infekční choroby. Obvykle předpokládáme, že jakmile se klinické rysy infekčního činidla vyřešily (jako je vyrážka z reaktivace VZV), jeho následný dopad na lidské zdraví je zanedbatelný. Přítomnost patogenních exosomů cirkulujících měsíce při absenci spouštěcího infekčního činidla naznačuje, že klinici musí zvážit infekční historii vzdálenou od doby prezentace cévní mozkové příhody nebo cévní choroby.
4. Využijte novou, špičkovou technologii (ExoView R200), která umožní třídění a charakterizaci jednotlivých exosomů, které nám pomohou pochopit heterogenitu populace. Tyto výsledky, spolu s větším tělem výsledků z 2 cílů (včetně dat exosomu), poskytnou data pro budoucí granty na objasnění funkce a buněk původu exosomových podmnožin.

Cíl odůvodnění studie 1. Analyzujte obsah exosomu pro známé vaskulární škodlivé proteiny/miRNA z odpovídajících kontrolních a Hz jedinců po dobu 12 měsíců. Pomocí hmotnostní spektrometrie a malého sekvenování RNA kvantifikujeme hojnost a časové změny exosomálních proteinů a miRNA spojených s vaskulární dysfunkcí, zánětem, koagulací a mrtvicí, pak koreluje analyty s klinickým a laboratorním rysy (anti-VZV IgG titry a titry APT/inr). Analýzy obohacení budou prováděny na síti exosomálních proteinů a miRNA pro odhalení cest a sdílených analytů spojených s Hz, vaskulární dysfunkcí a neurodegenerativními procesy.

Odůvodnění: Nedávno jsme zveřejnili, že během akutního Hz obsahují plazmatické exosomy zvýšené THBS1 a další proteiny spojené s vaskulární dysfunkcí.2 Dlouhodobá perzistence těchto proteinů rizikového faktoru však není známa a je nezbytná pro odhalení mechanismů zprostředkujících dlouhodobé riziko cévní demence a nakonec cílené intervenční terapie nad antivirovou léčbou. Vzhledem k epidemiologickém údajům korelujícím reaktivaci Hz a zvýšení diagnózy demence během 5 let, 15 a nedávno, silná korelace reaktivace Hz a rizika vaskulární demence, 13 Předpovídáme určité proteiny rizikového faktoru a miRNA zůstane zvýšená až po rok po reaktivaci HZ. Časová dynamika proteinů rizikového faktoru je kritickým krokem nad rámec akutních časových bodů, protože obvykle po vyrážkovací clearance jedinci již nejsou na antivirové terapii, jejichž rozšíření by se mohlo ukázat jako klinicky proveditelný a nákladově efektivní způsob, jak snížit riziko.

Cíl 2. Určete mechanismus (mechanismy), ve kterém neinfekční exosomy Hz podporují vaskulární dysfunkci. Plasma exosomes isolated from control and HZ individuals at timepoints above will be applied to human vascular endothelial cells derived from healthy donors or donors with APOE4 allele, then conditioned supernatant analyzed for proinflammatory cytokines (IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, a TNF-a) multiplexní ELISA. Buňky budou také analyzovány na generování reaktivních druhů kyslíku (ROS) a ukládání amyloidů. Kromě toho vystavíme destičky od zdravých dárců na kontrolu a exosomy Hz, abychom posoudili funkci destiček kvantifikací: (1) aktivace destiček (upregulace p-selektinu, aiibp3 a fosfatidylserinu) průtokovou cytometrií; (2) adheze a agregace destiček v testech mikrofluidního toku; a (3) stažení destiček pomocí testů kontrakce sraženiny. Poté budeme korelovat výsledky funkčního testu s klinickými a laboratorními rysy (výše), včetně vývoje mrtvice a dalších vaskulárních příhod u jedinců až 12 měsíců po Hz. K prozkoumání mechanismu patogeneze na molekulární úrovni budou provedeny experimenty specifických proteinů, jako je trombospondin-1, prozkoumány mechanismus patogeneze.

Odůvodnění: Navrhujeme prozkoumat patogenní účinky exosomů Hz na tři typy buněk integrovaných na vaskulární demenci, jmenovitě mozkové vaskulární advevenční fibroblasty (HBVAF), vaskulární endoteliální buňky (VEC) a destičky. Tím se snažíme odhalit mechanismy, které jsou základem epidemiologického důkazu zvýšeného rizika vaskulární demence vyvolané VZVV. Za prvé, je známo, že HBVAF hrají klíčovou roli při vaskulárním onemocněním a dysfunkcích prostřednictvím produkce reaktivních druhů kyslíku (ROS) a cytokinů, 76, jakož i proliferace a migrace adventitia během VZV vaskulopatií.10 Naše předběžná studie ukázala, že HBVAF vystaveny exosomům Plazmy Hz odebraných ve 3 měsících po Hz vyvolaly sekreci IL-6 a IL-8, což jsou klíčovými regulátory zánětu a struktury a funkce vaskulární stěny ve srovnání s exosomy kontroly plazmy.2 Doba trvání tohoto účinku, další cytokiny a produkce ROS nebyla objasněna a mohla hrát základní roli při chronické vaskulární dysfunkci pozorované u jedinců až 12 měsíců po Hz. Za druhé, VEC jsou také klíčovými komponenty ve vaskulární dysfunkci pozorované v případech vaskulární demence, se zvýšením produkce ROS a prozánětlivého uvolňování cytokinů, jakož i narušení těsných křižovatek zprostředkujících integritu krve-křemene. Kromě toho jsou alely apoe4 přepravující jednotlivci vystaveny zvýšenému riziku rozvoje vaskulární demence, 67-69, protože ApoE4 exprimující VEC vykazuje zvýšený prozánětlivý a protrombotický stav ve srovnání s jinými izoformami APOE.77 Proto navrhujeme prozkoumat, zda jsou patogenní účinky Hz exosomů zhoršeny u ApoE4 nesoucích jedince, porovnáním VEC odvozených jak z nosiče, tak non-nosiče ApoE4. A konečně, vaskulární demence je charakterizována okluzí průtoku krve do mozku, přičemž u pacientů byla pozorována hyperaktivita destiček. Naše předchozí studie odhalila, že exosomy Hz během akutní aktivace destiček indukovaly Hz a agregace destiček-leukocytů. Doba trvání tohoto účinku však není známa a bude testována na 12 měsíců po Hz, s klinicky používanými anti-destičkami a bez ní. Zjištění dlouhodobého dopadu exosomu Hz na aktivaci destiček a odpovídajícího zmírňujícího účinku anti-destičkových léčiv by mohla představovat klinicky proveditelný terapeutický zásah.

Předchozí zprávy popsaly prozánětlivou roli THBS1 v exosomech, když byly vystaveny makrofágům.78 Naše pilotní studie a předběžné údaje ukazují robustní zvýšení THSB1 u exosomů pacientů s Hz, ale ne kontroly.8 Proto, abychom otestovali, zda je zvýšená zátěž THBS1 v exosomech Hz zodpovědná za zvýšení uvolňování cytokinů a produkce ROS, provedeme experimenty expozice HBVAF a VEC v přítomnosti a nepřítomnosti inhibitoru THBS1, LSKL. Kromě toho je THBS1 silným aktivátorem TGFB1 a nadprodukce TGFB1 je pozorována u Alzheimerovy a vaskulárního onemocnění a indukuje cerebrovaskulární amyloidózu.79-81 Proto bude inhibitor THBS1 použit také v testech amyloidních depozicí k vyhodnocení exosomů přenášení, tvorby amyloidů zprostředkované THBS1 ve vaskulárních buňkách.

Návrh studie Tato studie je neintervenční/observační studie, která shromažďuje data účastníků a biospecimens za účelem analýzy obsahu exosomů pro známé vaskulární škodlivé proteiny/miRNA u jedinců Hz po dobu 12 měsíců (6 návštěv) ve srovnání s kontrolní skupinou (jedna návštěva).

AIM 1. Analyzujte obsah exosomu pro známé vaskulární škodlivé proteiny/miRNA z odpovídajících kontrolních a Hz jedinců po dobu 12 měsíců.

Anticipated results and interpretations: Based on our preliminary and published pilot study results, we expect to measure a significant increase in exosome proteins associated with thrombosis and vascular disease ("risk factor proteins") including THBS1, CAVIN-2, F5, F13A1, CALM1, and transthyretin (TTR) in plasma exosomes obtained from acute HZ individuals (initial visit) compared to those obtained from controls. Dále očekáváme, že tyto exosomální proteiny u jedinců Hz zůstanou během počáteční návštěvy na podobných úrovních a o 7 dní později, protože by byli pacienti na antivirové terapii; Poté za 1 a 3 měsíce očekáváme nárůst těchto proteinů v podskupině jedinců, kteří stále trvají virovou replikaci, která byla zpomalena pouze antivirotiky; Tito jedinci by měli titry VZV IgG, které se od počáteční návštěvy nesnížily (snižování titrů VZV IgG odráží produktivní infekci VZV a vrací se do latence), rostoucí titry VZV IgG od počáteční návštěvy nebo přetrvávající VZV IgM nebo přeměnu VZV IgM na pozitivní. Jinými slovy, předpovídáme, že hladiny VZV IgG budou odpovídat těmto zvýšením proteinů, které se zajímají o podskupinu jedinců Hz, což naznačuje probíhající virovou replikaci bez vyrážky u některých pacientů. Naše skupina skutečně již dříve oznámila přetrvávající uvolňování VZV ve slinách 67% jednotlivců Hz od 3 měsíců do 12 let po Hz bez přítomnosti vyrážky.56 Zvýšení proteinů exosomálního rizikového faktoru u jedinců Hz tedy může být způsobeno neúplným odstavením viru. Očekáváme, že tyto proteiny rizikového faktoru dosáhnou vrcholu přibližně 3 měsíce po Hz, poté poklesne na 6- a 12 měsících po Hz, protože studie jednotlivců VZV vaskulopatie ukázala průměrnou dobu od Hz do mrtvice je přibližně 4 měsíce.57 Navíc, vzhledem k tomu, že riziko mrtvice je nejvyšší u jedinců s HZO, 10 očekáváme, že exosomy od jedinců HZO budou mít nejvyšší úroveň proteinů rizikového faktoru mezi všemi jedinci Hz. Jak je předpovídáno v našich předběžných studiích, neočekáváme, že najdeme virové proteiny nebo cytokiny v exosomech kontrolních a Hz jedinců.

Pokud jde o sekvenování RNA exosomů Hz, neočekáváme, že uvidíme žádné virové transkripty, protože VZV DNA a RNA jsou během Hz zřídka detekovány (osobní komunikace, profesor Ravi Mahalingam). Očekáváme, že detekujeme změny v miRNA zapojených do cerebro- a kardiovaskulárních chorob, jako jsou miR-221 a miR-222, které jsou zvýšeny u jedinců s vaskulárním onemocněním, 73 miR-143, což je důležitým mediátorem plicní arteriální hypertenze, 74 a miR-31, což zvyšuje oxidační stres v vsulární hladkém musCle Cell.75 Je zajímavé, že předběžná studie v naší laboratoři ukázala významné zvýšení těchto miRNA v exosomech smyslových neuronů infikovaných VZV ve srovnání s exosomy z falešných infikovaných neuronů (obr. 2). Nakonec očekáváme, že ApoE4 přenášející jednotlivci budou mít nejrobustnější a nejtrvalejší proteiny/miRNA rizikového faktoru v jejich cirkulujícím exosomech vzhledem k ApoE4 je známým rizikovým faktorem pro vaskulární demenci.67-69

Cíl 2. Určete mechanismus (mechanismy), ve kterém neinfekční exosomy Hz podporují vaskulární dysfunkci.

Očekávané výsledky a interpretace: Naše pilotní studie cytokinů ukázaly zvýšení produkce IL-6 a IL-8 z HBVAF (což jsou klíčovými regulátory zánětu a struktury a funkce vaskulární stěny) po expozici exosomům Hz ve srovnání s kontrolami (obr. 3) .2 .2 .2. Předpovídáme, že to bude i nadále případ s větší velikostí vzorku a vyskytuje se ve VEC. Předpokládáme, že tyto cytokiny a produkce ROS dosáhne vrcholu na 1 a 3měsíční časové body. Pro většinu jedinců předpokládáme schopnost vyvolávat zánět a ROS v naivních buňkách se sníží o 12měsíční post-Hz, ale ApoE4 nesoucí VEC však pravděpodobně zůstane hyper-zánětlivé. Tento test jsme také provedli pomocí exosomů odvozených z falešných nebo VZV infikovaných lidských smyslových neuronů in vitro. Ve srovnání s simulovanými exosomy se exosomy kondicionované VZV (které jsou neinfekční) aplikované na naivní HBVAF významně zvýšené sekreci IL-6, IL-8 a IL-lp; Proto máme podezření, že exosomy, které vyvolávají zánětlivý cytokin, pocházejí z buněk infikovaných VZV. Vzhledem k tomu, že vidíme prodloužené zvýšení exosomů Hz obsahujících zvýšené proteiny rizikového faktoru a tyto exosomy Hz mohou stále indukovat IL-6 a IL-8 po 3 měsících po Hz2, naznačuje, že probíhají virovou replikaci (podmnožina nebo všichni) pacienti s Hz dobře po vyčištění. Jak je uvedeno výše, naše skupina ukázala aktivní uvolňování VZV ve slinách pacientů s Hz až 12 let po odbavení vyrážky.40 Předpovídáme také pozorování depozice amyloidů v buňkách vystavených exosomy Hz, ale nikoli na kontrolu a že tento účinek bude nejvýznamnější v ApoE4 nesoucím VEC. Nakonec imunofluorescenční barvení pravděpodobně vykazuje snížení zbarvení těsného spojení v Hz exponovaných VEC svědčících o narušení integrity krve-chlupová bariéra. Věříme, že patogenní procesy jsou částečně způsobeny zvýšenou zatížením THBS1 v exosomech Hz a že blokování aktivity THBS1 tyto účinky zmírňuje.

Na základě naší pilotní studie 2 Předpokládáme, že uvidíme zvýšení aktivace destiček, měřeno zvýšením destiček exprimujících p-selektin a fosfatidylserin po expozici exosomům Hz, ale ne kontrolu exosomů. Dále předpovídáme, že tento aktivační vzorec bude stále prominentní ve tříměsíčním časovém bodě svědčícím o trvalém riziku mrtvice, což je v souladu s epidemiologickými údaji; 20% expozice exosomů ze vzorků Hz bude pravděpodobně mít výraznější aktivační vzorec než 10%. Očekáváme, že vzorec aktivace po 12 měsících po Hz bude snížen a významně se neliší od kontrolních exosomů. Podobně předpokládáme, že v mikrofluidních modelech destiček vystavených exosomům Hz vystavených exponovaným regulačním exosomům vidíme zvýšení rychlosti a množství akumulace destiček a fibrinu. Očekáváme, že inhibitor CD36 zmírňuje účinky exozomu indukované Hz na funkci destiček, což poskytne silný mechanistický důkaz. Použití více metodik pro testování aktivace, agregace a funkce destiček, jakož i indukce prozánětlivých cytokinů, ROS a amyloidů pomocí HBVAF a VEC, vytvoříme komplexní funkční profil pro exosomy Hz při různých časových bodech během onemocnění. Výsledky z těchto studií budou mít kritické důsledky pro klinickou praxi a to, jak uvažujeme o reaktivaci VZV obecně. Konkrétně, pokud se ukázalo, že exosomy Hz jsou patologicky aktivní a poskytují funkční zvýšené riziko mrtvice a vaskulární dysfunkce, jak naznačují naše předběžné údaje, pak jsou zaručeny delší antivirovou léčbu a/nebo anti-deplateletová terapie. Konečně je pravděpodobné, že identifikujeme specifické proteiny v exosomech pomocí hmotnostní spektrometrie (v AIM 1), které budou korelovat s funkčními/mechanistickými testy navrženými v AIM 2. To by mohlo poskytnout další terapeutické intervenční cíle a předběžné údaje pro budoucí knock-down experimenty, kde jsou blokovány exosomální proteiny, aby byly zablokovány, aby bylo možné vidět, zda jsou aktivace destiček.