Исследование, которое собирает данные участников и биографические лица для анализа патогенных экзосомов, которые опосредуют повышенный риск деменции сосудов у людей с зостером герпеса. (R01)

Сосудистая деменция: сосудистая деменция является второй наиболее распространенной формой деменции после болезни Альцгеймера и в целом характеризуется как потери кровоснабжения в мозге и нарушение гематоэнцефалического барьера (BBB) ​​в конечном итоге к атрофии головного мозга и когнитивных нарушениям. и факторы риска развития сосудистой деменции. Недавно вирусы были определены как потенциальные факторы риска.

Вирус вируса варицеллы (VZV) и сосудистой дисфункции: VZV является исключительно человеческим, двухцепочечным ДНК альфахерпесвирусом, который продуцирует ветряную оспу (ветряную оспу), устанавливает латентность в сенсорных и автономных ганглионе. У 3 человека для производства герпеса Зостера (Гц; черепица) и других неврологических заболеваний с или без сыпи. Несмотря на наличие двух вакцин против Гц, более 1 миллиона американцев развиваются в год. Менее известно широкой общественности частота реактивации VZV без сыпи (Zoster Sine Herpete). Учитывая, что VZV реактивирует от ганглионических нейронов по всей нейроксисе, по существу все органы и ткани, включая сосудистую сеть, подвержены инфекции и заболеваниям без характерной и диагностической сыпи Гц. Фактически, предсказано, что на каждый 1 случай Гц с сыпью 7 особей будут реактивировать с VZV без соответствующего сыпи.39 Кроме того, наша группа показала, что люди все еще могут сбросить активное вирус в своей слюне до 12 лет после HZ, предполагая, что, по крайней мере, подмножество людей может иметь постоянную репликацию, несмотря на то, что не раздирается; В этом исследовании 67% пациентов все еще имели активное вирус в слюне, по крайней мере, через 3 месяца после RASH.40 Таким образом, бремя заболевания VZV, особенно продолжительность, вероятно, сильно недооценивается.

Гц признан как фактор риска инсульта; Гц увеличивает риск инсульта до 1 года после Гц, при этом риск выше, когда Гц происходит в офтальмологическом распределении или у людей <40 лет. В частности, данные, объединенные из 9 исследований в США, Европе и Азии, показывают, что относительный риск инсульта после Гц составлял 1,78 (95% ДИ 1,70-1,88) В течение первого месяца после ГЗ, постепенно снижаясь до 1,20 (95% ДИ 1,14-1,26) Через 1 год.41 Риск инсульта увеличился с большим отрывом в течение первого месяца после эпизода HZ Ophthalmicus: относительный риск составил 2,05 (95% ДИ 1,82-2,31); И риск инсульта оставался повышенным через год после острых эпизодов. 41 Недавнее ретроспективное исследование в США 23 339 ГЗ удивительных и 46 378 контролей, исследователи обнаружили, что в течение 8-недельного совокупного периода у людей ГЗ значительно чаще страдают от инсульта: скорректированные соотношения частоты заболеваемости для всех пациентов и пациентов в возрасте от 18 до 49 лет составляли 1,40 (95% ДИ, 0,93-2,11). и 8,12 (95% ДИ, 0,93-71,27), соответственно (р <0,05); Риск вернулся в базовый уровень на 1 год.42 Повышенный риск инсульта у лиц с ГЗ, которым <50 лет, по сравнению со всеми людьми ГЗ, примечателен, потому что эти люди не имеют права на вакцину против ГЗ.

В то время как механизмы, лежащие в основе VZV и сосудистых заболеваний, не полностью выяснены, гистологические и иммуногистохимические исследования артерий, инфицированных VZV, анализ спинномозговой жидкости (CSF) у пациентов с сосудосулопатией VZV для некоторых цитокинов и матричных металлопротеиназ (MMPS) и in vito, и in vito обеспечивают некоторые из ColeSees-NAGEL (MMPS) и in vitro, и в in vitro, и в in vitro, в течение некоторого неэтинизаса (MMPS, и in vitro, и в in vitro в отношении клучан в стиле. 2018) 10. В частности, после реактивации VZV вирус путешествует по нервным волокнам, которые заканчиваются в самом внешнем адвентиальном слое артерии, где вирус, инфицированные, фибробласты, выявляющие вирусы, вызывают устойчивый воспалительный ответ, включающий нейтрофилы ранним заболеванием, а также Т-клетки и макрофаги на протяжении всей болезни. VZV-инфицированные клетки, нейтрофилы и другие инфильтрирующие иммунные клетки продуцируют активированные MMP, которые разлагают внеклеточный матрикс, потенциально приводящий к ослаблению стенки сосуда, образованию аневризмы и разрыву. Было также описано, что растворимые факторы, секретируемые воспалительными клетками, дополнительно способствуют гибели гладких мышц сосудов и накоплению миофибробластов в утолщенной интиме, что потенциально приводит к окклюзии артерий. Тем не менее, «растворимые факторы» не были охарактеризованы до недавнего времени нашей группой (описано ниже).

Роль экзосом в болезненных состояниях: циркулирующие экзосомы стали важными «растворимыми факторами», которые могут влиять на клетки, удаленные от места их происхождения. Экзосомы представляют собой небольшие внеклеточные везикулы (диаметром ~ 40-200 нм) эндосомного происхождения, которые переносят груз (белки, нуклеиновые кислоты и т. Д.) из клеток их происхождения в соседние или дистальные клетки для связи во время нормальных и патологических состояний, регулирующие биологические процессы и ответ на болезнь.43. Например, экзосомы, полученные из тромбоцитов, мегакариоцитов и мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) могут переносить CXCR4, а CCR5, в которых отсутствуют эти рецепторы, тем самым увеличивая количество восприимчивых клеток для ВИЧ -инфекции.4445, тем самым увеличивая количество восприимчивых клеток для ВИЧ. 44,45. В других исследованиях экзосомы, высвобождаемые из клеток карциномы носоглотки, положительные для EBV, содержат вирусную скрытую мембранную мембранную белок 1 и другие вирусные/клеточные факторы, которые манипулируют микроокружением опухоли, чтобы усилить прогрессирование опухоли и облегчать иммунные ответы на опухолевые клетки 46-50. 46-50. Кроме того, экзосомы (и другие внеклеточные везикулы), полученные из:

1. Клетки рака молочной железы вызывают активацию и агрегацию тромбоцитов, способствуя ассоциированному с раком тромбоза51; и
2. VZV-инфицированные первичные сосудистые сосудистые фибробласты головного мозга человека опосредуют дисфункцию и передачу вирионов. Недавно мы опубликовали пилотное исследование, показывающее патогенные экзосомы плазмы от пациентов с острым ГЗ, являются протромботическими и провоспалительными. Специфические белки, которые были значительно повышены в экзосомах Гц и вовлечены в пути активации тромбоцитов, передачи сигналов и агрегации, включали тромбоспондин 1 (THBS1), 53,54, ассоциированные с кавеолами белок 2 (Cavin-2), 55 фактор коагуляции V (F5), 56 и коагуляционный фактор XII A1 (F13A1) 57 (фиг. 1). Белки заболевания сердечно -сосудистой системы, повышенные в экзосомах Гц, включали кальмодулин 1 (calm1) и трансфиретин (TTR) (рис. 1). Повышенный кальмодулин 1 может способствовать окислительному стрессу, связанному с гибелью нервных клеток после гипоксической травмы головного мозга, и является предиктором плохих результатов инсульта.58,59 Хотя повышенный транстиретин сыворотки был связан с улучшенными ишемическими результатами инсульта, 60 транстеретин также может олигомеризировать и вызывать окислительный стресс, воспаление и токсичность клетки.61,62 Действительно, во время Гц факторы, способствующие амилоиду, присутствуют в плазме, 8 потенциально вызывая агрегацию повышенного циркулирующего транстиретина в токсическую олигомерную форму в артериях, напоминающую церебральную амилоидную ангиопатию (CAA).

Связь между сосудистой деменцией и VZV: как описано выше, было показано, что VZV является причинным агентом вышеупомянутых факторов риска (инсульт, сосудистое воспаление и т. Д.). Кроме того, недавнее эпидемиологическое исследование из двух независимых баз данных (Finngen и UKB) показало, что реактивация VZV значительно увеличивает риск развития сосудистой деменции, в частности (2,33 и 6,22, соответственно; отношения опасности) .13. Барьер в принятии VZV и вирусов в целом для развития сосудистой деменции и болезни Альцгеймера - это отсутствие или непоследовательное присутствие вирусного антигена/нуклеиновых кислот в больных тканях во время смерти. Хотя это может быть потенциально объяснено феноменом «удара» (ткани инфекции вируса, вызывает необратимое повреждение, но впоследствии очищается), мы предполагаем, что неинфекционные экзосомы, продуцируемые в периферии (дорсальный корень и гангемиальные ганглии), могли способствовать отдаче заболевания. Механизмы, в которых VZV непосредственно вносит вклад в патологию сосудистой деменции в отсутствие литической инфекции, не были изучены и находятся в центре внимания этого предложения. Взятые вместе, мы предполагаем, что циркулирующие экзосомы в ГГ и в последующие месяцы будут способствовать васкулиту и тромбозу, обеспечивая тем самым механистическую основу для повышенного риска дисфункции сосудов, предшествующего деменции сосудов.

Значение: существуют сильные эпидемиологические и корреляционные данные, связывающие VZV и деменцию, включая сосудистые заболевания и болезнь Альцгеймера.13,15-20 Тем не менее, нехватка механистических доказательств привела к нерешительности причинно -следственной связи. Таким образом, это предложение направлено на устранение этого разрыва в знаниях путем систематического тестирования роли патогенных, долговечных экзосом после Гц на процессах сосудистых заболеваний. Механистически раскрытие белков/miRNAs, представляющих интерес, может потенциально изменить клиническую практику в отношении продолжительности противовирусной терапии и использования антилеровых агентов для Гц, а также увеличить поддержку вакцинации для предотвращения сыпь и смягчения риска инсульта и сосудистой деменции. Кроме того, наши результаты будут служить моделью для того, как другие патогены могут оказывать долгосрочное воздействие на участках, удаленных от областей инфекции, и стимулировать дальнейшие исследования биологических последствий экзосом, ассоциированных с патогенами.

Инновации и воздействие: это предложение имеет несколько областей инноваций. Продольная характеристика и механистическое исследование циркулирующих экзосом во время Гц и 12-месячных постов будут:

1. обеспечить механистическое понимание эпидемиологически наблюдаемого повышенного риска сосудистой деменции и инсульта после Гц. Прямой вклад вирусов в деменцию, включая сосудистую деменцию и болезнь Альцгеймера, все еще является спорным, учитывая, что большинство данных, связывающих эти два, являются эпидемиологическими и корреляционными. Данные, полученные в этом предложении, предоставят непредвзятую механистическую информацию о том, как VZV может непосредственно привести к сосудистым заболеваниям, что приводит к столь необходимым причинно-образным доказательствам фактора риска ранней стадии или его отсутствия.
2. Изменение клинического лечения. В настоящее время модифицируемые факторы риска инсульта и сосудистых заболеваний включают гипертонию, курение, диабет и гиперхолестеринемию. Поскольку эти патогенные экзосомы увеличивают риск тромбоза и васкулита, модификация фактора риска инсульта должна включать вакцинацию HZ с неживой субъединичной вакциной (Shingrix). Если происходит Гц, антивирусная терапия более длительной продолжительностью может быть оправдана, как определено нашими результатами, показывающими продолжительность времени эти патогенные экзосомы, а также анти-плательные и антиплютирные агенты. При наличии также может быть использование для новой терапии, которая предотвращает выпуск/слияние экзосомы.
3. Измените парадигму инфекционных заболеваний. Как правило, мы предполагаем, что после того, как клинические признаки инфекционного агента разрешились (например, сыпь от реактивации VZV), его последующее влияние на здоровье человека незначительно. Наличие патогенных экзосом, циркулирующих в течение нескольких месяцев в отсутствие запускающегося инфекционного агента, предполагает, что клиницисты должны рассматривать инфекционную историю, удаленную от времени инсульта или сосудистого заболевания.
4. Используйте новую, передовую технологию (Exoview R200), которая позволит сортировать и характеризовать отдельные экзосомы, чтобы помочь нам понять неоднородность населения. Эти результаты, наряду с большим количеством результатов из 2 целей (включая данные секвенирования экзосомы), будут предоставлять данные для будущих грантов, чтобы выяснить функцию и ячейки происхождения экзосомы.

Обоснование исследования AIM 1. Проанализируйте содержание экзосомы для известных сосудистых белков/miRNAs из соответствующего контроля и HZ-индивидуумов в течение 12-месячного периода. Используя масс-спектрометрию и небольшую РНК-секвенирование, мы будем количественно определять численность и временные изменения экзосомных белков и miRNAS, связанных с дисфункцией сосудов, воспаления, коагуляции и инсульта, затем коррелируют анализы с клиническими и лабораторными признаками (анти-VZV Igg Titters и IGM, полные количества крови, комплексная метаблическая панель и APTT/PT). Анализ обогащения будет проводиться в сети экзосомных белков и miRNAs для раскрытия путей и общих аналитов, связанных с HZ, сосудистой дисфункцией и нейродегенеративными процессами.

Обоснование: недавно мы опубликовали, что во время острых ГЗ экзосомы плазмы содержат повышенные THBS1 и другие белки, связанные с сосудистой дисфункцией.2. Тем не менее, продольная стойкость этих белков фактора риска неизвестна и является необходимым для раскрытия механизмов, опосредующих долгосрочный риск деменции сосудов, и, в конечном итоге, нацеленной на интервенционную терапию за пределами противовирусного лечения. Учитывая эпидемиологические данные, коррелирующие реактивацию HZ и увеличение диагноза деменции в течение 5 лет, 15, а в последнее время сильная корреляция реактивации Гц и риска деменции сосудов 13 мы предсказываем определенные белки фактора риска и miRNAs оставаться повышенными вплоть до года после реактивации Гц. Временная динамика белков фактора риска является критическим шагом за пределами острых временных точек, потому что, как правило, после того, как люди с разрешением больше не находятся на противовирусной терапии, расширение которого может оказаться клинически осуществимым и экономически эффективным способом снижения риска.

Цель 2. Определить механизм (ы), в котором неинфекционные экзосомы Гц способствуют сосудистой дисфункции. Экзосомы плазмы, выделенные из контрольных и HZ-индивидуумов при условиях, приведенных выше, будут применены к эндотелиальным клеткам сосудов человека, полученных от здоровых доноров или доноров с аллелем APOE, а затем кондиционированный супернатант, проанализированный на провоспалительные цитокины (IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, il-8, IL-1P70, IL-2, IL-4, IL-6, il-8, IL-1P70, IL-2, IL-4, IL-6, il-8, il-1, IL-2, IL-4, IL-6, il-8, IL-1. IL-13 и TNF-α) с помощью мультиплексного ELISA. Клетки также будут проанализированы на генерацию реактивных форм кислорода (АФК) и амилоидного осаждения. Кроме того, мы будем подвергать тромбоциты от здоровых доноров для контроля и экзосомов Гц для оценки функции тромбоцитов путем количественной оценки: (1) активации тромбоцитов (активация P-селектина, αIIBβ3 и фосфатидилсерина) проточной цитометрией; (2) адгезия тромбоцитов и агрегация в анализах микрофлюидного потока; и (3) ретракция тромбоцитов с помощью анализа сокращения сгустка. Затем мы будем коррелировать результаты функциональных анализов с клиническими и лабораторными функциями (выше), включая развитие инсульта и других сосудистых событий у людей до 12 месяцев после HZ. Нокаутные эксперименты специфических белков, таких как тромбоспондин-1, будут проводиться для исследования механизма патогенеза на молекулярном уровне.

Обоснование: мы предлагаем исследовать патогенные эффекты экзосомов Гц на три типа клеток, интегрированные для сосудистой деменции, а именно, адавенциальные фибробласты сосудов головного мозга (HBVAF), эндотелиальные клетки сосудов (VEC) и тромбоциты. Таким образом, мы стремимся раскрыть механизмы, лежащие в основе эпидемиологических доказательств VZV-индуцированного повышенного риска сосудистой деменции. Во -первых, известно, что HBVAF играют ключевую роль в сосудистых заболеваниях и дисфункции посредством производства реактивных форм кислорода (АФК) и цитокинов, 76, а также пролиферации и миграции адвентиции во время случая VZV -сосудов.10. Наше предварительное исследование показало, что HBVAF, подвергшиеся воздействию экзосом HZ Plasma, взятых через 3 месяца после HZ, индуцировали секрецию IL-6 и IL-8, которые являются ключевыми регуляторами воспаления и структуры и функции стенки сосудов, по сравнению с контрольными экзосомами плазмы.2.2. Тем не менее, продолжительность этого эффекта, другие цитокины и производство АФК не были выяснены и могут сыграть фундаментальную роль в хронической дисфункции сосудов, наблюдаемой у людей до 12 месяцев после HZ. Во-вторых, VEC также являются ключевыми компонентами в сосудистой дисфункции, наблюдаемой в случаях сосудистой деменции, с увеличением продукции АФК и провоспалительного высвобождения цитокинов, а также нарушение плотных соединений, опосредующих целостность кровь-брейра. Кроме того, аллель APOE4, несущие людей, подвергается повышенному риску развития сосудистой деменции, 67-69, поскольку APOE4, экспрессирующие VEC, демонстрируют повышенное провоспалительное и протромботическое состояние по сравнению с другими изоформами APOE.77 Таким образом, мы предлагаем выяснить, усугубляются ли патогенные эффекты экзосом Гц у людей, несущих apoe4, путем сравнения VEC, полученных как от носителя, так и из невозможного APOE4. Наконец, сосудистая деменция характеризуется окклюзией кровотока в мозг, с гиперактивностью тромбоцитов у пациентов. Наше предыдущее исследование показало, что экзосомы Гц во время острой Гц индуцировали активацию тромбоцитов и агрегации тромбоцитов-леко-лейкоцитов. Тем не менее, продолжительность этого эффекта неизвестна и будет протестирована до 12 месяцев после ГЗ, с клинически используемыми анти-платетными агентами и без него. Обнаружение долгосрочного воздействия экзосомы Гц на активацию тромбоцитов и соответствующее смягчающее действие анти-пролетных препаратов может представлять собой клинически осуществимое терапевтическое вмешательство.

В предыдущих отчетах описана провоспалительная роль для THBS1 в экзосомах при воздействии макрофагов.78 Наше пилотное исследование и предварительные данные показывают надежное увеличение THSB1 в экзосомах пациентов с ГЗ, но не контроли. Следовательно, чтобы проверить, отвечает ли повышенная нагрузка THBS1 в экзосомах Гц ответственностью за увеличение высвобождения цитокинов и выработки АФК, мы проведем эксперименты по воздействию HBVAF и VEC в присутствии и отсутствии ингибитора THBS1, LSKL. Кроме того, THBS1 является мощным активатором TGFB1, и перепроизводство TGFB1 наблюдается при болезни Альцгеймера и сосудов и вызывает цереброваскулярный амилоидоз.79-81 Следовательно, ингибитор THBS1 также будет использоваться в анализах амилоидного осаждения для оценки экзосомного образования, опосредованного THBS1 амилоидного образования в сосудистых клетках.

Дизайн исследования Это исследование представляет собой не вмешательство/обсервационное исследование, которое собирает данные участников и биопсимины для анализа содержания экзосомы для известных сосудистых белков/miRNAs у индивидуумов Гц в течение 12-месячного периода (6 посещений) по сравнению с контрольной группой (одно визит).

Цель 1. Проанализируйте содержание экзосомы для известных сосудистых белков/miRNAs из соответствующего контроля и HZ-индивидуумов в течение 12-месячного периода.

Ожидаемые результаты и интерпретации: на основе наших предварительных и опубликованных результатов пилотных исследований мы ожидаем измерения значительного увеличения белков экзосомы, связанных с тромбозом и сосудистыми заболеваниями («белки фактора риска»), включая THBS1, Cavin-2, F5, F13A1, CALM1 и транстиретин (TTR) в экзосомах Plasma, полученных с OCT-отдельных лиц (те, которые используются по сравнению, по сравнению) по сравнению) по сравнению) по сравнению) по сравнению). Кроме того, мы ожидаем, что эти экзосомные белки у людей Гц останутся на одинаковых уровнях во время первоначального посещения и через 7 дней, потому что пациенты были бы на противовирусной терапии; Затем, через 1 и 3 месяца, мы ожидаем увеличения этих белков у подмножества людей, у которых все еще есть постоянная репликация вируса, которая была просто замедлена с антивирусными препаратами; У этих людей были бы титры VZV IgG, которые не уменьшались с момента первоначального посещения (уменьшение титров IgG VZV, отражающих продуктивное разрешение инфекции VZV и возвращение вирусов к латентности), повышение титров IgG VZV с момента первоначального визита или постоянного VZV IGM или обращения VZV от отрицательного в положительное в положительное. Другими словами, мы предсказываем, что уровни IgG VZV будут соответствовать этим повышениям в белках, представляющих интерес к подмножеству особей Гц, что предполагает постоянную репликацию вируса без опрометчика у некоторых пациентов. Действительно, наша группа ранее сообщала о постоянном проливании VZV в слюне 67% людей Гц с 3 месяцев до 12 лет после Гц без присутствия сыпи.56 Таким образом, повышение белков экзосомного фактора риска у особей Гц может быть связано с неполным отключением вируса. Мы ожидаем, что эти белки фактора риска достигнут пика примерно через 3 месяца после Гз, а затем снизились через 6- и 12-месячные после-ГЗ, потому что исследование людей VZV-васкулопатии показало среднее время от ГГ до инсульта примерно 4 месяца. 57. 57 Кроме того, учитывая, что риск инсульта является самым высоким для людей с HZO, 10, мы ожидаем, что экзосомы от HZO -индивидуумов будут иметь самый высокий уровень белков фактора риска среди всех людей HZ. Как и предсказывалось в наших предварительных исследованиях, мы не ожидаем найти вирусные белки или цитокины в экзосомах контроля и индивидуумов HZ.

Что касается секвенирования РНК экзосом Гц, мы не ожидаем увидеть какие -либо вирусные транскрипты, потому что ДНК и РНК VZV редко обнаруживаются во время Гц (личные коммуникации, профессор Рави Махалингам). Мы ожидаем обнаружения изменений в микроРНК, участвующих в церебро- и сердечно-сосудистых заболеваниях, таких как miR-221 и miR-222, которые повышены у людей с сосудистыми заболеваниями, 73 miR-143, что является важным медиатором легочной артерий, 74 и miR-31, который увеличивает окислительный стресс в гладких мышечных мышцах сосудистых мышц. Интересно, что предварительное исследование в нашей лаборатории показало значительное повышение этих микроРНК в экзосомах чувственных нейронов, инфицированных VZV, по сравнению с экзосомами из фиктивных инфицированных нейронов (Fig. 2). Наконец, мы ожидаем, что у ApoE4 люди будут иметь наиболее надежные и постоянные белки фактора риска/miRNAs в их циркулирующих экзосомах, учитывая, что APOE4 является известным фактором риска для сосудистой деменции.67-69

Цель 2. Определить механизм (ы), в котором неинфекционные экзосомы Гц способствуют сосудистой дисфункции.

Ожидаемые результаты и интерпретации. Наши исследования пилотных цитокинов показали увеличение производства IL-6 и IL-8 из HBVAF (которые являются ключевыми регуляторами воспаления и структуры и функции стенки сосудов) после воздействия экзосом Гц по сравнению с контролями (рис. 3). Мы прогнозируем, что это будет продолжаться с большим размером выборки и будет происходить в VEC. Мы предполагаем, что эти цитокины и производство АФК пикают в 1- и 3-месячные временные мирошения. Для большинства людей мы предполагаем способность вызывать воспаление, а АФК в наивных клетках уменьшится на 12 месяцев после HZ, однако, несущие APOE4, несущие VECS, вероятно, останется гипер-воспалительным. Мы также провели этот анализ с использованием экзосом, полученных из макетных или VZV-инфицированных сенсорных нейронов человека in vitro. По сравнению с фиксированными экзосомами, VZV-кондиционированные экзосомы (которые неинфекционные), применяемые к наивным HBVAFS, значительно увеличивают секрецию IL-6, IL-8 и IL-1β; Поэтому мы подозреваем, что экзосомы, которые вызывают воспалительные продукты цитокинов, происходят из VZV-инфицированных клеток. Учитывая, что мы видим длительное повышение экзосомов Гц, содержащих повышенные белки фактора риска, и эти экзосомы Гц все еще могут индуцировать IL-6 и IL-8 через 3 месяца после HZ2, предполагает, что у пациентов с HZ продолжается постоянная репликация вируса (в подмножестве или все) пациентах с ГЗ. Как отмечалось выше, наша группа показала активное проливание VZV в слюне пациентов с ГЗ до 12 лет после очистки сыпь.40 Мы также прогнозируем наблюдение за осаждением амилоида в клетках, подвергшихся воздействию экзосомов Гц, но не контроля, и что этот эффект будет наиболее заметным в APOE4, несущих VEC. Наконец, иммунофлуоресцентное окрашивание, вероятно, покажет снижение плотного окрашивания соединения в ГГ, обнаруженных VEC, указывает на нарушение целостности кровавого мозга. Мы считаем, что патогенные процессы частично связаны с повышенной нагрузкой THBS1 в экзосомах Гц, и блокирование активности THBS1 ослабляет эти эффекты.

Основываясь на нашем пилотном исследовании, 2 мы ожидаем увидеть увеличение активации тромбоцитов, измеренное увеличением тромбоцитов, экспрессирующих p-селектин и фосфатидилсерина после воздействия экзосом Гц, но не контролируют экзосомы. Кроме того, мы предсказываем, что эта схема активации все еще будет заметна в 3-месячный момент времени, указывающий на устойчивый риск инсульта, что согласуется с эпидемиологическими данными; Экзосома 20% от образцов Гц, вероятно, будет иметь более выраженную паттерн активации, чем 10%. Мы ожидаем, что схема активации через 12 месяцев после Гц будет снижена и существенно не отличается от контрольных экзосом. Точно так же мы ожидаем увидеть увеличение скорости и количества накопления тромбоцитов и фибрина в микрофлюидных моделях тромбоцитов, подвергшихся воздействию экзосомов Гц по сравнению с тромбоцитами, подвергшимися воздействию контрольных экзосомов. Мы ожидаем, что ингибитор CD36 ослабит индуцированное экзосомой эффект HZ на функцию тромбоцитов, что обеспечит прочные механистические данные. Используя несколько методологий для проверки активации, агрегации и функции тромбоцитов, а также индукции провоспалительных цитокинов, АФК и амилоида HBVAF и VEC, мы будем генерировать комплексный функциональный профиль для экзосомов Гц в различных временных точках по всему заболеванию. Результаты этих исследований будут иметь критические последствия для клинической практики и того, как мы думаем о реактивации VZV в целом. В частности, если показано, что экзосомы Гц патологически активны и придают функциональный повышенный риск инсульта и сосудистой дисфункции, как предполагают наши предварительные данные, тогда оправданы более длительное противовирусное лечение и/или анти-платетическая терапия. Наконец, вполне вероятно, что мы идентифицируем конкретные белки в экзосомах посредством масс-спектрометрии (в цель 1), которые будут коррелировать с функциональными/механистическими анализами, предложенными в AIM 2. Это может обеспечить дополнительные терапевтические интервенционные мишени и предварительные данные для будущих экспериментов, где экзосомные белки, интересующие интерес к тому, чтобы увидеть, активируется ли тромбоцита.