一项研究收集参与者数据和生物测量的研究，以分析培养疱疹带状疱疹患者血管痴呆风险增加的病原外泌体。 (R01)

血管性痴呆：血管性痴呆是仅次于阿尔茨海默氏病的第二常见痴呆症形式，其特征是脑部的血液供应损失并损害了血脑屏障（BBB）（BBB）最终导致脑萎缩和认知障碍。 （血栓形成）是血管痴呆发展的贡献者和风险因素。 最近，病毒被确定为潜在的危险因素。

Varicella带状疱疹病毒（VZV）和血管功能障碍：VZV是一种人类，双链DNA DNAα-α-α-α-α-α-α-α-α-然后在> 95％的成年人中建立毒和自主神经神经元内的感觉和自主神经元神经元内的潜伏期（chancos），少于95％，> 95％的成年人在35％的情况下，并不受反应的影响。三分之一的人产生带状疱疹（Hz；带状疱疹）和其他有皮疹的神经系统疾病。38 尽管有两种Hz疫苗的可用性，但每年有超过100万美国人的HZ。 公众鲜为人知的是VZV重新激活的频率，而没有皮疹（带状疱疹正弦疱疹）。 鉴于VZV从神经神经元中的整个神经元中重新激活，包括脉管系统在内的所有器官和组织都容易感染和疾病，没有特征性和诊断性HZ皮疹。 实际上，可以预测，对于Hz的每一例皮疹，有7个人将与VZV重新激活而无需皮疹。39 此外，我们的小组表明，在Hz后长达12年的唾液中，个人仍然可以在其唾液中散发活跃的病毒，表明至少一部分个人可能会持续复制，尽管没有皮疹；在这项研究中，有67％的患者至少3个月后仍有活性病毒。40 因此，VZV疾病的负担，尤其是持续时间，可能会严重低估。

HZ被认为是中风风险因素； Hz将中风的风险增加到Hz后1年，当Hz发生在眼科分布中或个人<40岁的个人中时，风险更高。41 具体而言，来自美国，欧洲和亚洲的9项研究的数据表明，Hz后中风的相对风险为1.78（95％CI 1.70-1.88） 在HZ之后的第一个月中，逐渐降至1.20（95％CI 1.14-1.26） 1年后41 Hz眼科发作后的第一个月，中风风险增加了更大的利润：相对风险为2.05（95％CI 1.82-2.31）； 急性发作后一年，中风的风险仍然升高。 41最近对23,339个Hz个体和46,378个对照组的美国回顾性研究发现，在8周的总期间，Hz个体可能会遭受中风的可能性明显高：所有18至49岁的患者调整了发病率比率为1.40（95％CI，0.93-2.11）（0.93-2.11） 和8.12（95％CI，0.93-71.27）， 分别（p <0.05）;风险恢复到基线1年。42 与所有Hz个体相比，HZ患者的中风风险增加了，因为这些人不符合Hz疫苗的资格。

虽然尚未完全阐明VZV和血管疾病的机制，但对VZV感染的动脉的组织学和免疫组织化学研究，对VZV血管瘤患者的脑脊液（CSF）分析，用于细胞因子和基质疾病（MMPS）（MMPS）（MMPS），以及一些及其疾病的病理（以及何种情况）（以及何种情况下）（以及何种情况下）（何种疾病）。 Bubak，2018年）10。 具体而言，在VZV重新激活后，病毒沿着神经纤维行驶，这些神经纤维终止在动脉的最外向层中，在该动脉中，病毒感染的外生成纤维细胞引起了疾病早期涉及中性粒细胞的强大炎症反应，在整个疾病的整个过程中T细胞和巨噬细胞。 VZV感染的细胞，中性粒细胞和其他浸润的免疫细胞会产生活化的MMP，从而降解细胞外基质可能导致血管壁，动脉瘤形成和破裂的衰弱。 还描述了由炎症细胞分泌的可溶性因子进一步导致平滑肌死亡和肌纤维细胞在增厚内膜中的积累，可能导致动脉闭塞。 但是，直到最近我们的小组（如下所述），“可溶性因素”才表征。

外泌体在疾病状态中的作用：循环外泌体已成为重要的“可溶性因子”，可能会影响远离其起源部位的细胞。 外泌体是携带货物（蛋白质，核酸等）的内体源的细胞外囊泡（直径约40-200 nm），从其原产细胞到邻近或远端细胞在正常和病理状态下进行通信，调节生物学过程和反应。43 例如，源自血小板，巨核细胞和外周血单核细胞（PBMC）的外泌体可以将CXCR4和CCR5转移到缺乏这些受体的细胞中，从而增加了HIV感染的易感细胞的数量。44455 在其他研究中，EBV阳性的鼻咽癌细胞释放的外泌体包含病毒潜在的膜蛋白1和其他病毒/细胞因子操纵肿瘤微环境，以增强肿瘤进展并减轻对肿瘤的免疫反应。46-50。 此外，来自：

1. 乳腺癌细胞诱导血小板激活和聚集，导致与癌症相关的血栓形成51；和
2. VZV感染的原发性人脑血管外在成纤维细胞介导内皮细胞功能障碍和病毒体的传播。52 我们最近发表了一项试验研究，显示急性Hz患者的致病性血浆外泌体是血栓形成和促炎的。2 在Hz外泌体中显着升高并参与血小板激活，信号传导和聚集途径的特定蛋白质包括血小板传播1（THBS1），53,54个小窝相关的蛋白2（Cavin-2），55凝结因子V（F5），56和凝结因子XIIII A1 A1链（F1）57（F1）57（F1）57（57）。 Hz外泌体中升高的心血管系统疾病蛋白包括钙调蛋白1（CALM1）和甲状腺素蛋白（TTR）（图1）。 升高的钙调蛋白1可能导致缺氧 - 缺血性脑损伤后与神经细胞死亡相关的氧化应激，并且是中风不良结果的预测指标。58,59 尽管血清经胸素增加与改善缺血性卒中结果有关，但60种经甲状腺素蛋白也可以寡聚并诱导氧化应激，炎症和细胞毒性。61,62 实际上，在Hz期间，血浆中存在促淀粉样蛋白促进因子，8可能导致循环经胆道蛋白增加的循环型促进性寡聚形式的汇总，以使人联想到大脑淀粉样血管疾病（CAA）。

血管痴呆和VZV之间的联系：如上所述，VZV已被证明是上述危险因素（中风，血管炎症等）的病因。 此外，来自两个独立数据库（Finngen和UKB）的最近流行病学研究发现，VZV重新激活显着增加了尤其是患有血管性痴呆的风险（分别为2.33和6.22；危险比）。13。 在死亡时，病毒抗原/核酸的缺乏或不一致的病毒抗原/核酸在死亡时缺乏或不一致的障碍是接受血管痴呆和阿尔茨海默氏病的障碍。 虽然这可以通过“撞击”现象（病毒感染组织，导致不可逆的损害但随后清除）来解释，但我们建议在周围（背根和三叉神经节）中产生的非传染性外生体可能导致远距离疾病的病毒性疾病。 VZV在没有裂解感染的情况下直接导致血管性痴呆病理学的机制尚未研究，并且是该建议的重点。 综上所述，我们假设在HZ和随后的几个月中循环外泌体将促进血管炎和血栓形成，从而为血管功能障碍增加的血管功能障碍风险增加提供了机械基础。

意义：有很强的流行病学和相关数据存在着连接VZV和痴呆症，包括血管疾病和阿尔茨海默氏病。13,15-20 但是，很少有机械证据导致犹豫地将两者联系起来。 因此，该提案旨在通过系统地测试Hz在Hz在血管疾病过程中的致病性，持久外泌体的作用来解决知识的这一差距。 从机械上讲，感兴趣的蛋白质/miRNA可能会改变抗病毒疗法持续时间和使用抗位于Hz的临床实践，并增加对疫苗接种的支持，以防止疫苗接种以防止皮疹和减轻震动和血管痴呆症的风险。 此外，我们的发现将作为其他病原体如何在远离感染区域产生长期影响的模型，并刺激对病原体相关外泌体的生物学后果的进一步研究。

创新和影响：该提案具有几个创新领域。 Hz和12个月期间循环外泌体的纵向表征和机理研究将：

1. 在Hz后，在流行病学上观察到的血管性痴呆和中风风险增加的机械理解。 鉴于大多数与两者联系在一起的数据是流行病学和相关性，病毒对痴呆症的直接贡献，包括血管性痴呆和阿尔茨海默氏病，仍然存在争议。 本提案中产生的数据将提供有关VZV如何直接导致血管疾病的无偏机械信息，从而贡献了急需的病因证据，证明了早期危险因素或缺乏危险因素。
2. 改变临床管理。 目前，可修改的中风和血管疾​​病危险因素包括高血压，吸烟，糖尿病和高胆固醇血症。 由于这些致病性外泌体增加了血栓形成和血管炎的风险，因此中风风险因素改变应包括与非活体亚基疫苗（Shingrix）的Hz疫苗接种。 如果发生Hz，则可以根据我们的结果确定持续时间抗病毒疗法的时间，这些结果表明这些致病性外泌体的长度持续存在，以及抗血小板和抗炎性剂。 如果有的话，也可能会用于防止外泌体释放/融合的新型治疗剂。
3. 改变传染病的范式。 通常，我们假设一旦感染剂的临床特征解决了（例如VZV重新激活的皮疹），其随后对人类健康的影响就可以忽略不计。 在没有触发感染剂的情况下，病原外泌体的存在数月循环数月表明，临床医生需要考虑与中风或血管疾病表现时期的传染病史。
4. 采用新的尖端技术（Exoview R200），可以使单个外泌体的分类和表征来帮助我们了解人口异质性。 这些结果以及来自两个目标的较大结果（包括外泌体测序数据），将为未来的赠款提供数据，以阐明外泌体子集的起源功能和原始细胞。

研究原理目标1。分析来自匹配的对照和HZ个体的已知血管破坏蛋白/miRNA的外泌体含量。 Using mass spectrometry and small RNA sequencing, we will quantify abundance and temporal changes of exosomal proteins and miRNAs associated with vascular dysfunction, inflammation, coagulation, and stroke, then correlate analytes with clinical and laboratory features (anti-VZV IgG titers and IgM, complete blood counts, comprehensive metabolic panel, and aPTT/PT/INR). 富集分析将在外泌体蛋白和miRNA网络上进行，以发现与Hz，血管功能障碍和神经退行性过程相关的途径和共享分析物。

理由：我们最近发表了在急性Hz期间，血浆外泌体含有升高的THBS1和其他与血管功能障碍相关的蛋白质。2 但是，这些危险因素蛋白的纵向持久性尚不清楚，并且必须揭示介导长期血管痴呆风险的机制，并最终靶向抗病毒治疗以外的介入疗法。 鉴于流行病学数据将Hz重新激活和痴呆症诊断在5年内的痴呆症诊断相关，最近15年，最近，Hz重新激活和血管痴呆症风险的强相关性，13我们预测，在HZ重新激活后，高达一年的某些风险因素蛋白和miRNA将保持升高。 危险因素蛋白的时间动力学是超出急性时间点的关键一步，因为通常，遵循轻率的清除率的人不再接受抗病毒药疗法，其扩展可能被证明是临床上可行且具有成本效益的降低风险的方法。

目标2。确定非感染Hz外泌体促进血管功能障碍的机制。 Plasma exosomes isolated from control and HZ individuals at timepoints above will be applied to human vascular endothelial cells derived from healthy donors or donors with APOE4 allele, then conditioned supernatant analyzed for proinflammatory cytokines (IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13,和TNF-α）由多重ELISA。 还将分析细胞的活性氧（ROS）产生和淀粉样蛋白沉积。 此外，我们将通过量化以下量化：（1）通过流式细胞仪定量（1）血小板激活（1）血小板激活（p-选择素，αIIBβ3和磷脂酰丝氨酸的上调）来评估血小板功能的血小板； （2）微流体流量测定中的血小板粘附和聚集； （3）通过凝块收缩测定法回缩血小板。 然后，我们将将功能测定结果与临床和实验室特征（上图）相关联，包括在Hz后长达12个月的个体中中风和其他血管事件的发展。 将进行特定蛋白（例如血小板传播1）的敲低实验，以研究分子水平的发病机理。

基本原理：我们建议研究Hz外泌体对血管痴呆不可或缺的三种细胞类型的致病作用，即脑血管外增生成纤维细胞（HBVAFS），血管内皮细胞（VECS）和血小板。 通过这样做，我们旨在发现VZV引起的血管痴呆风险升高的流行病学证据的基础机制。 首先，已知HBVAF通过产生活性氧（ROS）和细胞因子，76，以及VZV VSV VASCULOPOPAPERAPHY病例中的复发性的增殖和迁移。10101010 我们的初步研究表明，在3个月后接受的Hz血浆外泌体暴露于Hz等离子体外泌体诱导了IL-6和IL-8的分泌，IL-6和IL-8是炎症和血管壁结构和功能的关键调节剂，与对照血浆相比。 但是，这种作用的持续时间，其他细胞因子和ROS产生尚未阐明，并且可能在Hz后长达12个月的个体中看到的慢性血管功能障碍发挥基本作用。 其次，VEC也是在血管痴呆病例中观察到的血管功能障碍的关键组成部分，ROS产生和促炎细胞因子释放增加，并且介导了介导血脑屏障完整性的紧密连接处的破坏。 此外，载有个体的APOE4等位基因患有血管性痴呆的风险较高，67-69作为APOE4表达VEC的VEC表现出增强的促炎性和促血栓性状态，与其他APOE相比。7777 因此，我们建议通过比较源自APOE4的载体和非载体的VEC来研究Hz外泌体在APOE4携带个体中的致病作用是否加剧。 最后，血管性痴呆的特征是流向大脑的血液流动，患者观察到血小板多动症。 我们先前的研究表明，急性Hz期间的Hz外泌体诱导血小板激活和血小板 - 白细胞聚集。 但是，这种效果的持续时间尚不清楚，并将在Hz后12个月进行测试，并且有或没有临床使用的抗血小板药物。 Hz外泌体对抗斑块药物的血小板激活和相应缓解作用的持久影响可能代表临床上可行的治疗干预措施。

先前的报告描述了暴露于巨噬细胞时THBS1在外泌体中的促炎作用。78 我们的试点研究和初步数据显示，HZ患者外部外泌体THSB1的强劲增加，但不能对照。88 因此，为了测试Hz外泌体中THB1的升高是否导致细胞因子释放和ROS产生的增加，我们将在存在和不存在THBS1抑制剂LSKL的情况下进行HBVAF和VEC暴露实验。 此外，在阿尔茨海默氏病和血管疾病中观察到TGFB1的有效活化剂，TGFB1的生产过多，并诱导脑血管淀粉样变性。79-81 因此，THBS1抑制剂也将用于淀粉样沉积测定法中，以评估血管细胞中的外泌体携带，THBS1介导的淀粉样蛋白形成。

研究设计本研究是一项非际交往/观察性研究，该研究收集参与者的数据和生物测量，以分析HZ个体中已知的血管损害蛋白/miRNA的外粒子含量在12个月内（6个访问）与对照组相比（一次访问）（一次访问）（一次访问）。

AIM 1。分析来自匹配的对照和HZ个体的已知血管破坏蛋白/miRNA的外泌体含量。

Anticipated results and interpretations: Based on our preliminary and published pilot study results, we expect to measure a significant increase in exosome proteins associated with thrombosis and vascular disease ("risk factor proteins") including THBS1, CAVIN-2, F5, F13A1, CALM1, and transthyretin (TTR) in plasma exosomes obtained from acute HZ individuals (initial visit) compared to those obtained from controls. 此外，我们预计HZ个体中的这些外泌体蛋白质在初次访问期间将保持相似的水平，并且在7天后，患者会接受抗病毒药疗法。然后，在1和3个月时，我们预计在仍有持续的病毒复制的个体中，这些蛋白质会增加，而病毒式复制仅通过抗病毒药而减慢。这些人将具有自初次访问以来没有减少的VZV IgG滴度（减少VZV IgG滴度（减少VZV IgG滴度反映了生产性的VZV感染解决方案，并且病毒恢复到潜伏期），自初次访问或持久访问或持久vzv vzv Igm或VZV Igm的vzv Igm或VZV Igm从负面到阳性的vzv IgG滴度上升。 换句话说，我们预测，VZV IgG水平将与Hz个体一部分中感兴趣的蛋白质中的这些升高相对应，这表明某些患者的病毒复制持续而没有皮疹。 实际上，我们的小组以前已经报道了唾液中VZV持续的Hz个体，Hz后3个月至12年，而没有皮疹。56 因此，Hz个体中外泌体危险因子蛋白的升高可能是由于病毒的关闭不完全。 我们预计这些危险因素蛋白在Hz后大约3个月会达到峰值，然后在Hz后6个月和12个月下降，因为对VZV VasculoPathy个体的研究表明，Hz到中风的平均时间约为4个月。57.57。 此外，鉴于HZO患者的中风风险最高，我们预计来自HZO个体的外泌体将在所有HZ个体中具有最高水平的危险因素蛋白质。 正如我们的初步研究所预测的那样，我们不希望在对照和HZ个体的外泌体中找到病毒蛋白或细胞因子。

关于Hz外泌体的RNA测序，我们不希望看到任何病毒记录，因为在Hz期间很少检测到VZV DNA和RNA（个人通讯，Ravi Mahalingam教授）。 我们期望检测到与脑血和心血管疾病有关的miRNA中的改变，例如miR-221和miR-222，它们在血管疾病的个体中升高，73 miR-143，这是肺动脉高压剂的重要介质，是肺动脉高压的重要介质，74和miR-31，增加了血管性平滑肌肉细胞的氧化应激。 有趣的是，与来自模拟感染神经元的外泌体相比，在我们实验室进行的初步研究表明，这些miRNA在VZV感染的感觉神经元外泌体中显着升高（图2）。 最后，我们预计APOE4承载个体在给定APOE4的循环外泌体中具有最强大，最持续的危险因素/miRNA是血管性痴呆的已知危险因素。67-69

目标2。确定非感染Hz外泌体促进血管功能障碍的机制。

预期的结果和解释：我们的试验性细胞因子研究表明，与对照组相比，HBVAFS（这是HBVAFs（这是炎症和血管壁结构和功能）的关键调节剂的IL-6和IL-8的增加，与对照组相比（图3）。23）。 我们预测，这种情况将继续存在，并发生在VEC中。 我们假设这些细胞因子，而ROS产生将在1个月和3个月的时间点达到顶峰。 对于大多数人来说，我们假设诱导炎症的能力和幼稚细胞中的ROS将减少12个月后Hz，但是，携带VEC的APOE4可能会保持过度炎症。 我们还使用在体外源自模拟或VZV感染的人类感觉神经元的外泌体进行了此测定。 与模拟外泌体相比，对幼稚的HBVAF的VZV条件外泌体（非感染）显着增加了IL-6，IL-8和IL-1β的分泌。因此，我们怀疑触发炎症细胞因子产生的外泌体来自VZV感染的细胞。 鉴于我们看到含有危险因素蛋白的Hz外泌体长期升高，而这些Hz外泌体在Hz2后3个月仍可以诱导IL-6和IL-8，这表明在Rash清除后，HZ 2（一个或所有）Hz患者井井有条。 如上所述，我们的小组在清除皮疹后长达12年的Hz患者的唾液中显示了活跃的VZV脱落。40 我们还预测，会在暴露于Hz外泌体的细胞中观察到淀粉样蛋白沉积，但不能观察到对照，并且这种作用在携带VEC的APOE4中最为突出。 最后，免疫荧光染色可能会显示出Hz暴露的VEC中紧密连接染色的降低，表明血脑屏障完整性破坏了。 我们认为，致病过程部分归因于Hz外泌体中Thbs1的载荷升高，而阻止THBS1的活性会减弱这些影响。

基于我们的试点研究，2我们预计，通过暴露于Hz外泌体但无法控制外泌体的血小板的增加，血小板激活的增加会增加。 此外，我们预测，这种激活模式在3个月的时间点仍将突出，这表明持续的中风风险与流行病学数据一致。 Hz样品中20％的外泌体暴露可能比10％更明显的激活模式。 我们预计，Hz后12个月的激活模式将减少，并且与对照外泌体没有显着差异。 同样，与暴露于对照外泌体的血小板相比，我们预计在暴露于Hz外泌体的小血小板的微流体模型中，血小板和纤维蛋白积累的速率和纤维蛋白积累量会增加。 我们希望CD36抑制剂能够减轻Hz外泌体诱导的对血小板功能的影响，这将提供强大的机械证据。 使用多种方法测试血小板激活，聚集和功能，以及HBVAF和VEC诱导促炎性细胞因子，ROS和淀粉样蛋白的产生，我们将在各种疾病的各种时间点上为HZ外泌体生成HZ外泌体的全面功能。 这些研究的结果将对临床实践以及我们对VZV重新激活的看法具有关键意义。 具体而言，如我们的初步数据所表明的那样，如果HZ外泌体证明具有病理活性并赋予功能性增加的中风和血管功能障碍的风险，则保证较长的抗病毒治疗和/或抗血域疗法。 Finally, it is likely we will identify specific proteins in the exosomes via mass spectrometry (in Aim 1) that will correlate with the functional/mechanistic assays proposed in Aim 2. This could provide further therapeutic interventional targets and preliminary data for future knock-down experiments where exosomal proteins of interest are blocked to see if platelet activation is attenuated.