Un estudio que recopila datos de participantes y bioespecímenes para analizar exosomas patógenos que median el mayor riesgo de demencia vascular en individuos con herpes zoster. (R01)

Demencia vascular: la demencia vascular es la segunda forma más común de demencia después de la enfermedad de Alzheimer y se caracteriza ampliamente como una pérdida de suministro de sangre para el cerebro y la barrera hematoencefálica comprometida (BBB) ​​finalmente conduce a la atrfulación cerebral y al deterioro cognitivo. (trombosis) son contribuyentes y factores de riesgo para el desarrollo de la demencia vascular. Recientemente, los virus se han identificado como factores de riesgo potenciales.

Varicella zoster virus (VZV) and vascular dysfunction: VZV is an exclusively human, double-stranded DNA alphaherpesvirus that produces varicella (chickenpox) then establishes latency within sensory and autonomic ganglionic neurons30-35 in >95% of adults in the U.S.36,37 With aging and immunosuppression, VZV reactivates in at least 1 de cada 3 individuos para producir herpes zoster (Hz; herpes zóster) y otras enfermedades neurológicas con o sin erupción.38 A pesar de la disponibilidad de dos vacunas de Hz, más de 1 millón de estadounidenses desarrollan HZ anualmente.9 Menos conocido por el público en general es la frecuencia de la reactivación de VZV sin erupción (Zoster sine herpete). Dado que VZV se reactiva de las neuronas ganglionares en toda la neuroxis, esencialmente todos los órganos y tejidos, incluida la vasculatura, son propensas a la infección y la enfermedad sin la erupción de Hz característica y diagnóstica. De hecho, se predice que por cada 1 caso de Hz con erupción cutánea, 7 individuos reactivarán con VZV sin una erupción correspondiente.39 Además, nuestro grupo ha demostrado que los individuos aún pueden arrojar virus activos en su saliva hasta 12 años después de la Hz, lo que sugiere que al menos un subconjunto de individuos puede tener una replicación continua a pesar de que no hay erupción. En este estudio, el 67% de los pacientes todavía tenían virus activo en su saliva al menos 3 meses después de la rash.40 Por lo tanto, la carga de la enfermedad de VZV, particularmente la duración, probablemente esté muy subestimada.

HZ es reconocido como un factor de riesgo de accidente cerebrovascular; Hz aumenta el riesgo de accidente cerebrovascular hasta 1 año después de la Hz, con un riesgo mayor cuando se produce Hz en la distribución oftálmica o en individuos <40 años de edad.41 Específicamente, los datos agrupados de 9 estudios en los EE. UU., Europa y Asia muestran que el riesgo relativo de accidente cerebrovascular después de HZ fue de 1.78 (IC 95% 1.70-1.88) Durante el primer mes después de Hz, cayendo progresivamente a 1.20 (IC 95% 1.14-1.26) Después de 1 año.41 El riesgo de accidente cerebrovascular aumentó en un margen mayor durante el primer mes después de un episodio de Hz Ophthalmicus: el riesgo relativo fue de 2.05 (IC 95% 1.82-2.31); y el riesgo de accidente cerebrovascular permaneció elevado un año después del episodio agudo. 41 Un estudio retrospectivo reciente de EE. UU. De 23,339 individuos Hz y 46,378 controles, los investigadores encontraron que durante el período agregado de 8 semanas, los individuos de Hz tenían significativamente más probabilidades de sufrir un accidente cerebrovascular: las relaciones de tasa de incidencia ajustadas para todos los pacientes y los pacientes de 18 a 49 años fueron 1.40 (IC 95%, 0.93-2.11) y 8.12 (IC 95%, 0.93-71.27), respectivamente (p <0.05); El riesgo regresó al inicio por 1 año.42 El mayor riesgo de accidente cerebrovascular en personas con HZ que tienen <50 años de edad, en comparación con todos los individuos de HZ, es notable porque estas personas no califican para la vacuna HZ.

Mientras que los mecanismos subyacentes a VZV y enfermedad vascular no están completamente dilucidados, estudios histológicos e inmunohistoquímicos de arterias infectadas con VZV, análisis de líquido cefalorraquídeo (LCR) desde pacientes con vasculopatía VZV para pacientes con citocinas y metaloproteinasas de matriz (MMPS) e in vitro proporcionan algunos clames a la enfermedad de la enfermedad (revisión de la enfermedad (revisión de la enfermedad (burbujas y burbujas y burbujas y burbujas y burbujas, y los estudios in vitro proporcionan clames a la enfermedad de la enfermedad (revisión de la enfermedad (burbujas y burbujas y burbujas, y los estudios in vitro de la enfermedad (revisones de la enfermedad (burbujas y burbujas. 2018) 10. Específicamente, tras la reactivación de VZV, el virus viaja a lo largo de las fibras nerviosas que terminan en la capa adventicial más externa de la arteria, donde los fibroblastos adventiciales infectados por virus provocan una respuesta inflamatoria robusta que involucra neutrófilos temprano en la enfermedad, y las células T y las macrófagas en todo el curso de la enfermedad. Las células infectadas con VZV, los neutrófilos y otras células inmunes infiltrantes producen MMP activadas, que degradan la matriz extracelular potencialmente, lo que conduce al debilitamiento de la pared del vaso, la formación de aneurismas y la ruptura. También se ha descrito que los factores solubles secretados por las células inflamatorias contribuyen aún más a la muerte del músculo liso vascular y la acumulación de miofibroblastos en la íntima engrosada, lo que potencialmente conduce a la oclusión arterial. Sin embargo, los "factores solubles" no han sido caracterizados hasta hace poco por nuestro grupo (descrito a continuación).

Paper de los exosomas en los estados de la enfermedad: los exosomas circulantes han surgido como "factores solubles" importantes que pueden afectar a las células remotas de su sitio de origen. Los exosomas son pequeñas vesículas extracelulares (~ 40-200 nm de diámetro) de origen endosómico que transportan carga (proteínas, ácidos nucleicos, etc.) de sus células de origen a células adyacentes o distales para la comunicación durante estados normales y patológicos, regulando procesos biológicos y respuesta a la enfermedad. Por ejemplo, los exosomas derivados de plaquetas, megacariocitos y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) pueden transferir CXCR4 y CCR5 a células que carecen de estos receptores, aumentando así el número de células susceptibles para la infección por VIH. En otros estudios, los exosomas liberados de las células de carcinoma nasofaríngeo positivo para EBV contienen la proteína de la membrana latente viral 1 y otros factores virales/celulares que manipulan el microambiente tumoral para mejorar la progresión tumoral y aliviar las respuestas inmunes a las células tumorales. 46-50 Además, los exosomas (y otras vesículas extracelulares) derivadas de:

1. Las células de cáncer de mama inducen la activación y agregación de plaquetas, contribuyendo a la trombosis asociada al cáncer51; y
2. Los fibroblastos adventiciales vasculares humanos primarios infectados por VZV median la disfunción de las células endoteliales y la transmisión de viriones.52 Recientemente hemos publicado un estudio piloto que muestra los exosomas de plasma patógeno de pacientes con HZ aguda son protrombóticos y proinflamatorios.2 Las proteínas específicas que se elevaron significativamente en los exosomas de Hz e involucradas en la activación plaquetaria, la señalización y las vías de agregación incluyeron trombospondina 1 (THBS1), 53,54 proteína asociada a caveolas (Cavin-2), 55 factor de coagulación V (F5), 56 y factor de coagulación XIII A1 (F13A1) 57 (Fig. 1). Las proteínas de la enfermedad del sistema cardiovascular en los exosomas de Hz incluyeron calmodulina 1 (Calm1) y transtiretina (TTR) (Fig. 1). La calmodulina 1 elevada puede contribuir al estrés oxidativo asociado con la muerte de las células neurales después de la lesión cerebral hipóxica-isquémica y es un predictor de pobres resultados de accidente cerebrovascular.58,59 Aunque el aumento de la tranetiretina sérica se ha asociado con mejores resultados de accidente cerebrovascular isquémico, 60 transtiretina también pueden oligomerizar e inducir estrés oxidativo, inflamación y toxicidad celular.61,62 De hecho, durante el HZ, los factores que promueven el amiloide están presentes en el plasma, 8 potencialmente causando la agregación del aumento de la transtiretina circulante a la forma oligomérica tóxica en las arterias que recuerdan a la angiopatía amiloide cerebral (CAA).

Vínculo entre la demencia vascular y el VZV: como se describió anteriormente, se ha demostrado que VZV es un agente causal de los factores de riesgo antes mencionados (accidente cerebrovascular, inflamación vascular, etc.). Además, un estudio epidemiológico reciente de dos bases de datos independientes (Finngen y UKB) encontró que la reactivación de VZV aumenta significativamente el riesgo de desarrollar demencia vascular en particular (2.33 y 6.22, respectivamente; relaciones de riesgo) .13 Una barrera en la aceptación de VZV y virus en general para el desarrollo de la demencia vascular y la enfermedad de Alzheimer es la falta o la presencia inconsistente de antígeno/ácidos nucleicos del virus en los tejidos enfermos al momento de la muerte. Si bien esto puede explicarse potencialmente por un fenómeno "atropellado" (el virus infecta los tejidos, causa daño irreversible pero se elimina posteriormente), proponemos que los exosomas no infecciosos producidos en la periferia (raíz dorsal y ganglia trigeminal) pueden contribuir a la enfermedad distante del sitio de la replicación viral. Los mecanismos en los que VZV contribuye directamente a la patología de la demencia vascular en ausencia de una infección lítica no se han estudiado y es el foco de esta propuesta. Tomados en conjunto, planteamos la hipótesis de que los exosomas circulantes durante HZ y en los meses posteriores promoverán vasculitis y trombosis, proporcionando así una base mecanicista para el aumento del riesgo de disfunción vascular que precede a la demencia vascular.

Importancia: Existen datos epidemiológicos y correlacionales fuertes que vinculan VZV y demencia, incluida la enfermedad vascular y la enfermedad de Alzheimer.13,15-20 Sin embargo, una escasez de evidencia mecanicista ha resultado en una duda para vincular causativamente los dos. Por lo tanto, esta propuesta tiene como objetivo abordar esta brecha en el conocimiento probando sistemáticamente el papel de los exosomas patógenos y duraderos después de Hz en los procesos de enfermedad vasculares. Las proteínas/miRNA de interés de descubrimiento mecánico pueden cambiar potencialmente la práctica clínica con respecto a la duración de la terapia antiviral y el uso de agentes antigplateletales para HZ, así como aumentar el apoyo a la vacunación para prevenir el riesgo de aceleración y mitigas y el riesgo de demencia vascular. Además, nuestros hallazgos servirán como modelo de cómo otros patógenos pueden tener efectos duraderos en sitios alejados de regiones de infección y estimular más investigaciones sobre las consecuencias biológicas de los exosomas asociados a los patógenos.

Innovación e impacto: esta propuesta tiene varias áreas de innovación. La caracterización longitudinal y la investigación mecanicista de los exosomas circulantes durante Hz y la publicación de 12 meses:

1. Proporcione una comprensión mecanicista al mayor riesgo epidemiológicamente observado de demencia vascular y accidente cerebrovascular después de Hz. Las contribuciones directas de los virus a la demencia, incluida la demencia vascular y la enfermedad de Alzheimer, siguen siendo controvertidas dados la mayoría de los datos que vinculan los dos son epidemiológicos y correlacionales. Los datos generados en esta propuesta proporcionarán información mecanicista imparcial sobre cómo VZV puede conducir directamente a la enfermedad vascular, contribuyendo con evidencia causal muy necesaria de un factor de riesgo de etapa temprana o la falta de ella.
2. Cambiar el manejo clínico. Actualmente, los factores de riesgo de accidente cerebrovascular modificable y enfermedad vascular incluyen hipertensión, tabaquismo, diabetes e hipercolesterolemia. Debido a que estos exosomas patógenos aumentan el riesgo de trombosis y vasculitis, la modificación del factor de riesgo de accidente cerebrovascular debe incluir la vacunación de HZ con la vacuna contra la subunidad no viva (SHINGRIX). Si se produce HZ, la terapia antiviral de mayor duración puede justificarse según lo determine nuestros resultados que muestran el tiempo que persisten estos exosomas patogénicos, así como los agentes anti-plateletos y anti-inflamatorios. Cuando esté disponible, también puede haber un uso para novedosas terapéuticas que eviten la liberación/fusión del exosoma.
3. Cambiar el paradigma de la enfermedad infecciosa. Por lo general, suponemos que una vez que las características clínicas de un agente infeccioso han resuelto (como la erupción de la reactivación de VZV), su impacto posterior en la salud humana es insignificante. La presencia de exosomas patógenos que circulan durante meses en ausencia del agente infeccioso desencadenante sugiere que los médicos deben considerar la historia infecciosa alejada del momento del accidente cerebrovascular o la presentación de enfermedad vascular.
4. Emplee una nueva tecnología de vanguardia (Exoview R200) ​​que permitirá la clasificación y la caracterización de exosomas individuales para ayudarnos a comprender la heterogeneidad de la población. Estos resultados, junto con el mayor cuerpo de resultados de los 2 objetivos (incluidos los datos de secuenciación del exosoma), proporcionarán datos para futuras subvenciones para dilucidar la función y las células de origen de los subconjuntos exosomas.

Estudio de la justificación del objetivo 1. Analice el contenido de exosomas para las proteínas/miARN dañinos vasculares conocidos de los individuos de control coincidente y HZ durante un período de 12 meses. Usando espectrometría de masas y secuenciación de ARN pequeña, cuantificaremos la abundancia y los cambios temporales de las proteínas exosómicas y los miRNA asociados con la disfunción vascular, la inflamación, la coagulación y el accidente cerebrovascular, luego correlacionaron los análisis con las características clínicas y de laboratorio (títulos anti-VZV IgG e IGM, completos de sangre, cuentas de sangre completa, paneles metabólicos comprensivos y pleptt/apttt/ptr). Los análisis de enriquecimiento se realizarán en la red de proteínas exosómicas y miRNA para descubrir vías y analitos compartidos asociados con HZ, disfunción vascular y procesos neurodegenerativos.

Justificación: Hemos publicado recientemente que durante el Hz agudo, los exosomas en plasma contienen THBS1 elevadas y otras proteínas asociadas con la disfunción vascular.2 Sin embargo, la persistencia longitudinal de estas proteínas del factor de riesgo no se conoce y es imperativo de descubrir los mecanismos que median el riesgo de demencia vascular a largo plazo y, en última instancia, se dirigen a terapias intervencionistas más allá de los tratamientos antivirales. Dado los datos epidemiológicos que correlacionan la reactivación de HZ y un aumento en el diagnóstico de demencia en 5 años, 15 y más recientemente, la fuerte correlación de la reactivación de Hz y el riesgo de demencia vascular, 13 predecimos ciertas proteínas de factor de riesgo y miARN permanecerá elevada hasta un año posterior a la reactivación de HZ. La dinámica temporal de las proteínas del factor de riesgo es un paso crítico más allá de los puntos de tiempo agudos porque, por lo general, después de la aclaración preciosa, los individuos ya no están en la terapia antiviral, cuya extensión podría ser una forma clínicamente factible y rentable de reducir el riesgo.

Objetivo 2. Determine los mecanismos en los que los exosomas HZ no infecciosos promueven la disfunción vascular. Los exosomas plasmáticos aislados de los individuos de control y Hz en los puntos de tiempo anteriores se aplicarán a las células endoteliales vasculares humanas derivadas de donantes o donantes sanos con alelo APOE4, luego supernatante condicionado analizado para las citocinas proinflamatorias (IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, il-10, il-1β, IL-2, il-4, il-6, il-8, il-10, ill-120, ILL-120, il-120, il-120, il-120, il-120, il-12p70, il-12p70. IL-13, y TNF-α) por Multiplex ELISA. Las células también se analizarán para la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la deposición de amiloide. Además, expondremos las plaquetas de donantes sanos al control y exosomas HZ para evaluar la función de las plaquetas mediante la cuantificación de: (1) activación de plaquetas (regulación positiva de p-selectina, αiibβ3 y fosfatidilserina) por citometría de flujo; (2) adhesión y agregación de plaquetas en ensayos de flujo microfluídico; y (3) retracción plaquetaria por ensayos de contracción de coágulos. Luego correlacionaremos los resultados del ensayo funcional con características clínicas y de laboratorio (arriba), incluido el desarrollo de accidente cerebrovascular y otros eventos vasculares en las personas hasta 12 meses después de la Hz. Se realizarán experimentos de eliminación de proteínas específicas como la trombospondina-1 para investigar el mecanismo de patogénesis a nivel molecular.

Justificación: proponemos investigar los efectos patogénicos de los exosomas de HZ en tres tipos de células integrales a la demencia vascular, a saber, los fibroblastos adventiciales vasculares cerebrales (HBVAF), las células endoteliales vasculares (VECS) y las plaquetas. Al hacerlo, nuestro objetivo es descubrir los mecanismos subyacentes a la evidencia epidemiológica de un riesgo elevado de demencia vascular inducida por VZV. En primer lugar, se sabe que los HBVAF juegan un papel clave en la enfermedad vascular y la disfunción, a través de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y citocinas, 76, así como la proliferación y migración de la adventicia durante los casos de vasculopatía VZV.10 Nuestro estudio preliminar mostró que los HBVAF expuestos a los exosomas plasmáticos de Hz tomados a 3 meses después de Hz indujeron la secreción de IL-6 e IL-8, que son reguladores clave de la inflamación y la estructura y la función de la pared vascular, en comparación con el control de los exosomas plasmáticos.2 Sin embargo, la duración de este efecto, otras citocinas y la producción de ROS no se han dilucidado y podrían desempeñar un papel fundamental en la disfunción vascular crónica observada en individuos hasta 12 meses después de la Hz. En segundo lugar, los VEC también son componentes clave en la disfunción vascular observada en casos de demencia vasculares, con un aumento en la producción de ROS y la liberación de citocinas proinflamatorias, así como una interrupción en las uniones estrechas que median Además, los individuos que transportan el alelo APOE4 tienen un riesgo elevado de desarrollar demencia vascular, 67-69 como APOE4 que expresan VECS exhiben un estado proinflamatorio y protrombótico elevado en comparación con otras isoformas de ApoE.77. Por lo tanto, proponemos investigar si los efectos patogénicos de los exosomas de HZ se exacerban en los individuos que transportan APOE4, comparando las VEC derivadas de un portador y no transportista de APOE4. Por último, la demencia vascular se caracteriza por una oclusión del flujo sanguíneo al cerebro, con hiperactividad plaquetaria observada en pacientes. Nuestro estudio anterior reveló que los exosomas de Hz durante la activación de plaquetas inducidas por Hz y las agregaciones de leucocitos de plaquetas. Sin embargo, se desconoce la duración de este efecto y se evaluará a 12 meses después de la Hz, con y sin agentes antigplatelet utilizados clínicamente. El hallazgo de un impacto duradero del exosoma de HZ en la activación de plaquetas y el efecto mitigante correspondiente de los fármacos antigplateletales podría representar una intervención terapéutica clínicamente factible.

Informes anteriores han descrito un papel proinflamatorio para THBS1 en exosomas cuando se exponen a los macrófagos.78 Nuestro estudio piloto y datos preliminares muestran un aumento robusto en THSB1 en exosomas de pacientes con HZ pero no controles.8 Por lo tanto, para probar si la carga elevada de THBS1 en los exosomas de Hz es responsable del aumento en la liberación de citocinas y la producción de ROS, realizaremos los experimentos de exposición de HBVAF y VEC en presencia y ausencia de un inhibidor de THBS1, LSKL. Además, THBS1 es un potente activador de TGFB1 y la sobreproducción de TGFB1 se observa en la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad vascular e induce amiloidosis cerebrovascular. 79-81 Por lo tanto, el inhibidor de THBS1 también se utilizará en los ensayos de deposición de amiloide para evaluar la formación amiloide mediada por THBS1 en células vasculares.

Diseño del estudio Este estudio es un estudio no intervencionista/observacional que recopila datos de participantes y bioespecímenes para analizar el contenido de exosomas para proteínas/miARN dañinos vasculares conocidos en individuos de Hz durante un período de 12 meses (6 visitas) en comparación con el grupo de control (una visita).

Objetivo 1. Analice el contenido de exosomas para las proteínas/miARN dañinos vasculares conocidos del control coincidente y los individuos de HZ durante un período de 12 meses.

Resultados e interpretaciones anticipadas: según los resultados preliminares y publicados del estudio piloto, esperamos medir un aumento significativo en las proteínas exosomas asociadas con la trombosis y la enfermedad vascular ("proteínas de factor de riesgo"), incluidos THBS1, Cavin-2, F5, F13A1, Calm1, calm1 y transtiretina (TTR) (TTR) en los exosomas de Plasma obtenidos de los individuos de HZ (Visita inicial) en comparación con los controles. Además, esperamos que estas proteínas exosómicas en individuos de HZ permanezcan en niveles similares durante la visita inicial y 7 días después porque los pacientes habrían estado en terapia antiviral; Luego, a los 1 y 3 meses, esperamos un aumento en estas proteínas en un subconjunto de individuos que todavía tienen una replicación viral continua que simplemente se ralentizó con los antivirales; Estos individuos tendrían títulos de IGG VZV que no disminuyeron desde la visita inicial (disminución de los títulos de IGG VZV reflejan la resolución productiva de infecciones de VZV y el virus que regresa a la latencia), el aumento de los títulos de VZV IGG desde la visita inicial o el IGM VZV persistente o la conversión de VZV de IgM de negativo a positivo. En otras palabras, predecimos que los niveles de IgG de VZV corresponderán a estas elevaciones en las proteínas de interés en un subconjunto de individuos de Hz, lo que sugiere una replicación viral continua sin erupción en ciertos pacientes. De hecho, nuestro grupo ha informado previamente el desprendimiento persistente de VZV en la saliva del 67% de los individuos de HZ de 3 meses a 12 años después de Hz sin la presencia de una erupción.56 Por lo tanto, las elevaciones de las proteínas del factor de riesgo exosómico en los individuos de HZ pueden deberse al cierre incompleto del virus. Esperamos que estas proteínas de factor de riesgo alcancen aproximadamente 3 meses después de la Hz, luego disminuyen a 6 y 12 meses después de la Hz porque un estudio de los individuos de vasculopatía VZV mostró que el tiempo medio de Hz a accidente cerebrovascular es aproximadamente 4 meses.57.57.57. Además, dado que el riesgo de accidente cerebrovascular es más alto para las personas con HZO, 10 esperamos que los exosomas de individuos HZO tengan el nivel más alto de proteínas de factor de riesgo entre todos los individuos de HZ. Como se predice en nuestros estudios preliminares, no esperamos encontrar proteínas virales o citocinas en los exosomas de los individuos de control y HZ.

Con respecto a la secuenciación de ARN de los exosomas HZ, no esperamos ver ninguna transcripción viral porque el ADN y el ARN de VZV rara vez se detectan durante Hz (comunicaciones personales, profesor Ravi Mahalingam). Esperamos detectar alteraciones en los miRNA implicados en la enfermedad cerebro y cardiovascular como miR-221 y miR-222 que están elevados en individuos con enfermedad vascular, 73 miR-143, que es un mediador importante de la hipertensión arterial pulmonar, 74 y miR-31 que aumenta Curiosamente, un estudio preliminar en nuestro laboratorio mostró la elevación significativa de estos miRNAs en exosomas de neuronas sensoriales infectadas con VZV en comparación con los exosomas de las neuronas simuladas infectadas (Fig. 2). Finalmente, esperamos que APOE4 que transporte a las personas tenga las proteínas/miRNA de factor de riesgo más robustos y persistentes en sus exosomas circulantes dado APOE4 es un factor de riesgo conocido para la demencia vascular.67-69

Objetivo 2. Determine los mecanismos en los que los exosomas HZ no infecciosos promueven la disfunción vascular.

Resultados e interpretaciones anticipadas: Nuestros estudios piloto de citocinas mostraron un aumento en la producción de IL-6 e IL-8 a partir de HBVAF (que son reguladores clave de la inflamación y la estructura y función de la pared vascular) después de la exposición a los exosomas de Hz en comparación con los controles (Fig. 3) .2) .2. Predecimos que este continuará siendo el caso con un tamaño de muestra más grande y ocurrirá en los VEC. Presumimos estas citocinas y la producción de ROS alcanzará su punto máximo en los puntos de tiempo de 1 y 3 meses. Para la mayoría de los individuos, planteamos la hipótesis de la capacidad de inducir inflamación y ROS en células ingenuas disminuirá en 12 meses después de la Hz, sin embargo, es probable que APOE4 que transportara VECS permanecerá hiperflamatorios. También hemos realizado este ensayo utilizando exosomas derivados de neuronas sensoriales humanas infectadas simuladas o VZV in vitro. En comparación con los exosomas simulados, los exosomas condicionados con VZV (que no son infecciosos) se aplican a HBVAF sin tratamiento previo, aumentó significativamente la secreción de IL-6, IL-8 e IL-1β; Por lo tanto, sospechamos que los exosomas que desencadenan la producción de citocinas inflamatorias se originan en las células infectadas con VZV. Dado que vemos una elevación prolongada de exosomas de Hz que contienen proteínas de factor de riesgo elevadas y estos exosomas de Hz aún pueden inducir IL-6 e IL-8 a los 3 meses después de HZ2 sugiere que hay una replicación viral continua en (un subconjunto o todo) pacientes con HZ bien después de que se haya eliminado la erupción. Como se señaló anteriormente, nuestro grupo mostró un desprendimiento activo de VZV en la saliva de pacientes con HZ hasta 12 años después del aclaramiento de la erupción. 40 También predecimos observar la deposición de amiloide en las células expuestas a los exosomas de Hz pero no a los controles y que este efecto será más prominente en las VEC de transporte APOE4. Finalmente, la tinción inmunofluorescente probablemente mostrará una reducción en la tinción de unión apretada en VEC expuestos de HZ indicativos de una interrupción de la integridad de la barrera hematoencefálica. Creemos que los procesos patógenos se deben, en parte, a la carga elevada de THBS1 en los exosomas de Hz y que el bloqueo de la actividad de THBS1 atenuará estos efectos.

Según nuestro estudio piloto, 2 anticipamos ver un aumento en la activación de plaquetas medidas por un aumento en las plaquetas que expresan P-selectina y fosfatidilserina después de la exposición a los exosomas de Hz pero no de control de exosomas. Además, predecimos que este patrón de activación aún será prominente en el punto de tiempo de 3 meses indicativo de un riesgo sostenido de accidente cerebrovascular, consistente con los datos epidemiológicos; Es probable que la exposición al exosoma del 20% de las muestras de HZ tenga un patrón de activación más pronunciado que el 10%. Esperamos que el patrón de activación a los 12 meses después de HZ esté disminuido y no sea significativamente diferente de los exosomas de control. Del mismo modo, anticipamos ver un aumento en la tasa y la cantidad de plaquetas y acumulación de fibrina en los modelos microfluídicos de plaquetas expuestas a exosomas de Hz en comparación con las plaquetas expuestas a los exosomas de control. Esperamos que el inhibidor de CD36 atenúe los efectos inducidos por el exosoma de HZ en la función plaquetaria, lo que proporcionará una fuerte evidencia mecanicista. Utilizando múltiples metodologías para probar la activación de plaquetas, la agregación y la función, así como la inducción de la producción de citocinas, ROS y amiloide proinflamatorias por HBVAF y VECS, generaremos un perfil funcional integral para los exosomas Hz en varios puntos de tiempo a lo largo de la enfermedad. Los resultados de estos estudios tendrán implicaciones críticas para la práctica clínica y cómo pensamos en la reactivación de VZV en general. Específicamente, si los exosomas de Hz son patológicamente activos y confieren un mayor riesgo funcional de accidente cerebrovascular y disfunción vascular, como sugieren nuestros datos preliminares, entonces se justifica un tratamiento antiviral más largo y/o terapias antigotretarias. Finalmente, es probable que identifiquemos proteínas específicas en los exosomas a través de la espectrometría de masas (en el objetivo 1) que se correlacionarán con los ensayos funcionales/mecanicistas propuestos en el AIM 2. Esto podría proporcionar más objetivos terapéuticos de intervención y datos preliminares para futuros experimentos de derribo donde las proteínas exosómicas de interés se bloquean para ver si se atenan a la activación de plaqueteletet.