En studie som samler deltakerdata og biospekimer for å analysere patogene eksosomer som medierer økt vaskulær demensrisiko hos individer med herpes zoster. (R01)

Vaskulær demens: Vaskulær demens er den nest vanligste formen for demens etter Alzheimers sykdom og karakteriseres bredt som et tap av blodtilførsel til hjernen og kompromittert blod-hjernebarriere (BBB) ​​til slutt og fører til hjerneatrofi og kognitiv. (Trombose) er bidragsytere og risikofaktorer for utvikling av vaskulær demens. Nylig har virus blitt identifisert som potensielle risikofaktorer.

Varicella Zoster-virus (VZV) og vaskulær dysfunksjon: VZV er et eksklusivt menneskelig, dobbeltstrenget DNA-alfaherpesvirus som produserer varicella (vannkopper) og etablerer deretter latens i sensorisk og autonome ganglionic neurons30-35 i> 95% av voksne i U.S.36,. minst 1 av 3 individer for å produsere herpes zoster (Hz; helvetesild og andre nevrologiske sykdommer med eller uten utslett.38 Til tross for tilgjengeligheten av to Hz -vaksiner, utvikler mer enn 1 million amerikanere HZ årlig.9 Mindre kjent for allmennheten er hyppigheten av VZV -reaktivering uten utslett (Zoster sinus herpete). Gitt at VZV reaktiverer fra ganglioniske nevroner over hele nevraksis, er i hovedsak alle organer og vev, inkludert vaskulaturen, utsatt for infeksjon og sykdom uten det karakteristiske og diagnostiske Hz -utslettet. Faktisk er det spådd at for hvert 1 tilfelle av Hz med utslett, vil 7 individer reaktivere med VZV uten tilsvarende utslett.39 Videre har gruppen vår vist at individer fremdeles kan kaste aktivt virus i spytt opp til 12 år etter HZ som antyder at minst en delmengde av individer kan ha pågående replikering til tross for ikke noe utslett; I denne studien hadde 67% av pasientene fortsatt aktivt virus i spytt Dermed er byrden av VZV -sykdom, spesielt varighet, sannsynligvis grovt undervurdert.

HZ er anerkjent som en hjerneslagsrisikofaktor; Hz øker risikoen for hjerneslag opp til 1 år etter Hz, med risiko høyere når Hz oppstår i oftalmisk distribusjon eller hos individer <40 år.41 Spesifikt har data samlet fra 9 studier i USA, Europa og Asia at den relative risikoen for hjerneslag etter Hz var 1,78 (95% KI 1,70-1,88) Den første måneden etter Hz, falt gradvis til 1,20 (95% KI 1,14-1,26) Etter 1 år.41 Strokerisikoen økte med større margin i løpet av den første måneden etter en Hz Ophthalmicus-episode: Relativ risiko var 2,05 (95% KI 1,82-2,31); Og hjerneslagrisikoen forble forhøyet ett år etter den akutte episoden. 41 En fersk amerikansk retrospektiv studie av 23.339 Hz individer og 46.378 kontroller, fant etterforskerne at i løpet av den 8 ukers samlede perioden var Hz-individer betydelig mer sannsynlig å få hjerneslag: justert forekomstforhold for alle pasienter og pasienter i alderen 18 til 49 år var 1,40 (95% ci, 0,93-12.111111) og 8,12 (95% KI, 0,93-71,27), henholdsvis (p <0,05); Risiko returnerte til baseline innen 1 år.42 Den økte hjerneslagrisikoen hos individer med Hz som er <50 år, sammenlignet med alle Hz -individer, er bemerkelsesverdig fordi disse personene ikke kvalifiserer for HZ -vaksinen.

Mens mekanismene som ligger til grunn for VZV og vaskulær sykdom, ikke blir fullstendig belyste, histologiske og immunhistokjemiske studier av VZV-infiserte arterier, analyse av cerebrospinalvæske (CSF) fra VZV vaskulopatiske pasienter og cytokiner og matrise-metalloprotein ( Bubak, 2018) 10. Spesifikt, ved VZV-reaktivering, reiser virus langs nervefibre som avsluttes i det ytterste adventitale laget av arterien der virusinfiserte adventitielle fibroblaster fremkaller en robust inflammatorisk respons som involverer nøytrofiler tidlig i sykdom, og T-celler og makrofager gjennom hele løpet av sykdomsforløpet. VZV-infiserte celler, nøytrofiler og andre infiltrerende immunceller produserer aktiverte MMP-er, som nedbryter den ekstracellulære matrisen som potensielt kan føre til svekkelse av karveggen, aneurysmdannelse og brudd. Oppløselige faktorer som skilles ut av inflammatoriske celler er også blitt beskrevet for ytterligere å bidra til vaskulær glatt muskeldød og akkumulering av myofibroblaster i den tykne intima, noe som potensielt fører til arteriell okklusjon. Imidlertid har de "løselige faktorene" ikke blitt karakterisert før nylig av vår gruppe (beskrevet nedenfor).

Eksosomer i sykdomstilstander: Sirkulerende eksosomer har vist seg som viktige "oppløselige faktorer" som kan påvirke celler fjernt fra opprinnelsesstedet. Eksosomer er små ekstracellulære vesikler (~ 40-200 nm i diameter) av endosomal opprinnelse som bærer last (proteiner, nukleinsyrer, etc.) fra deres opprinnelsesceller til tilstøtende eller distale celler for kommunikasjon under normale og patologiske tilstander, regulerer biologiske prosesser og respons på sykdom.43 For eksempel kan eksosomer avledet fra blodplater, megakaryocytter og perifere blodmononukleære celler (PBMC) overføre CXCR4 og CCR5 til celler som mangler disse reseptorene, og derved øke antallet mottagelige celler for HIV -infeksjon.44,45 I andre studier inneholder eksosomer frigjort fra nasopharyngeal karsinomceller positive for EBV det virale latente membranproteinet 1 og andre virale/cellulære faktorer som manipulerer tumormikromiljøet for å forbedre tumorprogresjonen og lindre immunrespons til tumorceller.46-50 Videre er eksosomer (og andre ekstracellulære vesikler) avledet fra:

1. Brystkreftceller induserer blodplateaktivering og aggregering, og bidrar til kreftassosiert trombose51; og
2. VZV-infisert primær menneskelig hjernevaskulær adventitial fibroblaster formidler endotelcelledysfunksjon og overføring av virioner.52 Vi har nylig publisert en pilotstudie som viser patogene plasmaeksosomer fra pasienter med akutt Hz er protrombotisk og proinflammatorisk.2 Spesifikke proteiner som var betydelig forhøyet i Hz-eksosomer og involvert i blodplateaktivering, signalering og aggregeringsveier inkluderte trombospondin 1 (THBS1), 53,54 caveolae-assosiert protein (Cavin-2), 55 koagulasjonsfaktor V (F5), 56 (fig. 1). Kardiovaskulære systemsykdomsproteiner forhøyet i Hz -eksosomer inkluderte calmodulin 1 (Calm1) og transtyretin (TTR) (fig. 1). Forhøyet calmodulin 1 kan bidra til oksidativt stress assosiert med nevral celledød etter hypoksisk-iskemisk hjerneskade og er en prediktor for dårlige slagresultater.58,59 Selv om økt serum transthyretin har vært assosiert med forbedrede iskemiske slagresultater, kan 60 transthyretin også oligomerisere og indusere oksidativt stress, betennelse og celletoksisitet.61,62 Under Hz er faktisk amyloidfremmende faktorer til stede i plasma, 8 potensielt forårsaker aggregering av økt sirkulerende transthyretin til den giftige oligomere formen i arterier som minner om cerebral amyloid angiopati (CAA).

Kobling mellom vaskulær demens og VZV: Som beskrevet ovenfor, har VZV vist seg å være et årsaksmiddel for de nevnte risikofaktorene (hjerneslag, vaskulær betennelse, etc.). Videre fant en fersk epidemiologisk studie fra to uavhengige databaser (Finngen og UKB) VZV -reaktivering betydelig øker risikoen for å utvikle vaskulær demens (henholdsvis 2,33 og 6,22; fareforhold) .13 .13 .13. En barriere i aksept av VZV og virus generelt til utvikling av vaskulær demens og Alzheimers sykdom er mangelen eller inkonsekvent tilstedeværelse av virusantigen/nukleinsyrer i det syke vevet ved dødstidspunktet. Selv om dette potensielt kan forklares med et "hit-and-run" -fenomen (virus infiserer vev, forårsaker irreversibel skade, men deretter blir tømt), foreslår vi at ikke-smittsomme eksosomer produsert i periferien (dorsal rot og trigeminal ganglia) kan bidra til å være i dorsalrot og trigeminal ganglia) kan bidra til å bidra til å få sykdomsrekke. Mekanismene der VZV direkte bidrar til vaskulær demenspatologi i fravær av en lytisk infeksjon, har ikke blitt studert og er i fokus for dette forslaget. Samlet antar vi at sirkulerende eksosomer i løpet av Hz og i de påfølgende månedene vil fremme vaskulitt og trombose, og dermed gi et mekanistisk grunnlag for økt vaskulær dysfunksjonsrisiko før vaskulær demens.

Betydning: Sterk epidemiologiske og korrelasjonsdata eksisterer som kobler VZV og demens, inkludert vaskulær sykdom og Alzheimers sykdom.13,15-20 Imidlertid har en mangel på mekanistisk bevis resultert i en nøling med å årsakende å knytte de to. Dermed har dette forslaget som mål å adressere dette gapet i kunnskap ved systematisk å teste rollen som patogene, langvarige eksosomer etter Hz på vaskulære sykdomsprosesser. Mekanisk avdekking av proteiner/miRNA av interesse kan potensielt endre klinisk praksis med hensyn til varighet av antiviral terapi og bruk av anti-platelet-midler for Hz, samt øke støtten til vaksinasjon for å forhindre utslett og redusere hjerneslag og vaskulær demensrisiko. Videre vil funnene våre tjene som en modell for hvordan andre patogener kan ha langvarige effekter på steder fjernt fra infeksjonsregioner og stimulere videre forskning på de biologiske konsekvensene av patogenassosierte eksosomer.

Innovasjon og påvirkning: Dette forslaget har flere innovasjonsområder. Den langsgående karakterisering og mekanistisk undersøkelse av sirkulerende eksosomer under Hz og 12-måneders post vil:

1. Gi en mekanistisk forståelse for den epidemiologisk observerte økt risiko for vaskulær demens og hjerneslag etter Hz. De direkte bidragene fra virus til demens, inkludert vaskulær demens og Alzheimers sykdom, er fremdeles kontroversiell gitt at de fleste data som knytter de to er epidemiologiske og korrelasjonelle. Data generert i dette forslaget vil gi objektiv mekanistisk informasjon om hvordan VZV direkte kan føre til vaskulær sykdom, og bidra med mye tiltrengt forårsakende bevis på en risikofaktor i tidlig stadium eller mangel på dem.
2. endre klinisk behandling. For øyeblikket inkluderer risikofaktorer for modifiserbar hjerneslag og vaskulær sykdom hypertensjon, røyking, diabetes og hyperkolesterolemi. Fordi disse patogene eksosomene øker risikoen for trombose og vaskulitt, bør modifisering av hjerneslagfaktor omfatte Hz-vaksinasjon med den ikke-live underenhetsvaksinen (Shingrix). Hvis Hz oppstår, kan antiviral terapi lengre varighet være berettiget som bestemt av resultatene våre som viser hvor lang tid disse patogene eksosomene vedvarer, så vel som anti-platelet og anti-inflammatoriske midler. Når det er tilgjengelig, kan det også være bruk for nye terapeutika som forhindrer eksosomfrigjøring/fusjon.
3. Endre paradigmet for smittsom sykdom. Vanligvis antar vi at når de kliniske trekkene til et smittestoff har løst (for eksempel utslett fra VZV -reaktivering), er dens etterfølgende innvirkning på menneskers helse ubetydelig. Tilstedeværelsen av patogene eksosomer som sirkulerer i flere måneder i fravær av det utløsende smittestoffet antyder at klinikere må vurdere smittsom historie fjernt fra presentasjonen av hjerneslag eller vaskulær sykdom.
4. Bruk ny, banebrytende teknologi (Exoview R200) ​​som vil tillate sortering og karakterisering av enkelteksosomer for å hjelpe oss med å forstå populasjonsheterogeniteten. Disse resultatene, sammen med det større antall resultater fra de to målene (inkludert eksosomsekvenseringsdata), vil gi data for fremtidige tilskudd for å belyse funksjonen og opprinnelsescellene til eksosomundersettene.

Studie Begrunnelse AIM 1. Analyser eksosominnhold for kjente vaskulære skadelige proteiner/miRNA fra matchet kontroll og Hz individer over en 12-måneders periode. Ved bruk av massespektrometri og liten RNA-sekvensering, vil vi kvantifisere overflod og tidsmessige endringer av eksosomale proteiner og miRNA assosiert med vaskulær dysfunksjon, betennelse, koagulasjon og hjerneslag, deretter korrelere analytter med kliniske og laboratoriefunksjoner (anti-VZV IGG-titere og IGM, komplette blodtelling av kliniske teller. Anrikningsanalyser vil bli utført i nettverket av eksosomale proteiner og miRNA for å avdekke veier og delte analytter assosiert med Hz, vaskulær dysfunksjon og nevrodegenerative prosesser.

Begrunnelse: Vi har nylig publisert at under akutte Hz inneholder plasmaeksosomer forhøyet THBS1 og andre proteiner assosiert med vaskulær dysfunksjon.2 Imidlertid er ikke langsgående utholdenhet av disse risikofaktorproteinene kjent og er avgjørende for å avdekke mekanismene som medierer langvarig vaskulær demensrisiko og til slutt målrettet intervensjonsbehandlinger utover antivirale behandlinger. Gitt de epidemiologiske dataene som korrelerer Hz -reaktivering og en økning i demensdiagnose innen 5 år, 15 og mer nylig, den sterke korrelasjonen av Hz -reaktivering og vaskulær demensrisiko, 13 vi spår visse risikofaktorproteiner og miRNA vil forbli forhøyet i opptil et år etter HZ -reaktivering. Temporal dynamikk av risikofaktorproteinene er et kritisk skritt utover akutte tidspunkter fordi vanligvis etter utslettede individer ikke lenger er på antiviral terapi, hvis forlengelse kan vise seg å være en klinisk gjennomførbar og kostnadseffektiv måte å redusere risikoen på.

Aim 2. Determine the mechanism(s) in which non-infectious HZ exosomes promote vascular dysfunction. Plasma exosomes isolated from control and HZ individuals at timepoints above will be applied to human vascular endothelial cells derived from healthy donors or donors with APOE4 allele, then conditioned supernatant analyzed for proinflammatory cytokines (IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, and TNF-α) by multiplex ELISA. Cells will also be analyzed for reactive oxygen species (ROS) generation and amyloid deposition. I tillegg vil vi eksponere blodplater fra sunne givere til kontroll og Hz-eksosomer for å vurdere blodplatefunksjonen ved kvantifisering av: (1) blodplateaktivering (oppregulering av p-selectin, αIIBβ3 og fosfatidylserin) ved flytcytometri; (2) platelet adhesion and aggregation in microfluidic flow assays; and (3) platelet retraction by clot contraction assays. Vi vil deretter korrelere funksjonelle analyseresultater med kliniske og laboratoriefunksjoner (over), inkludert utvikling av hjerneslag og andre vaskulære hendelser i individene opptil 12 måneder etter HZ. Knock-down eksperimenter av spesifikke proteiner som trombospondin-1 vil bli utført for å undersøke mekanismen for patogenese på molekylært nivå.

Begrunnelse: Vi foreslår å undersøke de patogene effektene av Hz -eksosomer på tre celletyper integrert i vaskulær demens, nemlig hjernevaskulær adventitial fibroblaster (HBVAF), vaskulære endotelceller (VEC) og blodplater. Ved å gjøre det tar vi sikte på å avdekke mekanismene som ligger til grunn for det epidemiologiske beviset for VZV-indusert forhøyet risiko for vaskulær demens. For det første er det kjent at HBVAF - Vår foreløpige studie viste at HBVAF-er utsatt for Hz-plasmaeksosomer tatt ved 3-måneders etter-Hz induserte sekresjonen av IL-6 og IL-8, som er viktige regulatorer for betennelse og vaskulær veggstruktur og funksjon, sammenlignet for å kontrollere plasmaeksosomer.2 Imidlertid har ikke varigheten av denne effekten, andre cytokiner og ROS-produksjonen blitt belyst, og kan spille en grunnleggende rolle i kronisk vaskulær dysfunksjon sett hos individer opptil 12 måneder etter Hz. For det andre er VEC-er også viktige komponenter i vaskulær dysfunksjon observert i vaskulære demenstilfeller, med en økning i ROS-produksjon og proinflammatorisk cytokinfrigjøring, samt en forstyrrelse i trange veikryss medierende blod-hjerne-barrier-integritet. Videre har APOE4-allel med individer en forhøyet risiko for å utvikle vaskulær demens, 67-69 som APOE4 som uttrykker VEC-er viser en økt proinflammatorisk og protrombotisk tilstand sammenlignet med andre APOE-isoformer.77 Derfor foreslår vi å undersøke om de patogene effektene av Hz-eksosomer forverres i APOE4 som bærer individer, ved å sammenligne VEC-er avledet fra både en bærer og ikke-bærer av APOE4. Til slutt er vaskulær demens preget av en okklusjon av blodstrømmen til hjernen, med blodplatehyperaktivitet observert hos pasienter. Vår forrige studie avslørte at Hz-eksosomer under akutt Hz induserte blodplateaktivering og blodplate-leukocyttaggregasjoner. Imidlertid er varigheten av denne effekten ukjent og vil bli testet ut til 12 måneder etter Hz, med og uten klinisk brukte anti-platelet-midler. Funnet av en langvarig innvirkning av Hz-eksosom på blodplateaktivering og tilsvarende avbøtende effekt av anti-platelet-medisiner kan representere en klinisk gjennomførbar terapeutisk intervensjon.

Tidligere rapporter har beskrevet en pro-inflammatorisk rolle for THBS1 i eksosomer når de er utsatt for makrofager.78 Vår pilotstudie og foreløpige data viser en robust økning i THSB1 i eksosomer av Hz -pasienter, men ikke kontroller.8 For å teste om den forhøyede belastningen av THBS1 i Hz -eksosomer er ansvarlig for økningen i cytokinfrigjøring og ROS -produksjon, vil vi derfor gjennomføre HBVAF- og VEC -eksponeringseksperimentene i nærvær og fravær av en Thbs1 -hemmer, LSKL. Videre er Thbs1 en potent aktivator av TGFB1 og overproduksjon av TGFB1 observeres i Alzheimers og vaskulære sykdom og induserer cerebrovaskulær amyloidose.79-81 Derfor vil THBS1-hemmeren også bli brukt i amyloidavsetningsanalysene for å evaluere eksosombærende, Thbs1-mediert amyloiddannelse i vaskulære celler.

Studiedesign Denne studien er en ikke-intervensjonell/observasjonsstudie som samler deltakerdata og biospekimener for å analysere eksosominnhold for kjente vaskulære skadelige proteiner/miRNA hos Hz individer over en 12 måneders periode (6 besøk) sammenlignet med kontrollgruppe (ett besøk).

Mål 1. Analyser eksosominnhold for kjente vaskulære skadelige proteiner/miRNA fra matchet kontroll og Hz individer over en 12-måneders periode.

Forventede resultater og tolkninger: Basert på våre foreløpige og publiserte pilotstudieresultater, forventer vi å måle en betydelig økning i eksosomproteiner assosiert med trombose og vaskulær sykdom ("Risikofaktorproteiner") inkludert Thbs1, Cavin-2, F5, de f13A1, Calm1 og Transthyretin (Initial Witr) kontroller. Videre forventer vi at disse eksosomale proteiner hos Hz -individer vil forbli på lignende nivåer under det første besøket og 7 dager senere fordi pasienter ville ha vært på antiviral terapi; Så etter 1 og 3 måneder forventer vi en økning i disse proteinene i en undergruppe av individer som fremdeles har pågående viral replikasjon som bare ble bremset med antivirale midler; Disse personene ville ha VZV IgG -titere som ikke reduserte siden det første besøket (redusert VZV IgG -titere gjenspeiler produktiv VZV -infeksjonoppløsning og virus som vender tilbake til latens), og stiger VZV IgG -titere siden første besøk, eller vedvarende VZV IGM eller konvertering av VZV IGM fra negativt positivt. Med andre ord, vi spår at VZV IgG -nivåene vil samsvare med disse høydene i proteiner av interesse i en undergruppe av Hz individer, noe som antyder pågående viral replikasjon uten utslett hos visse pasienter. Faktisk har gruppen vår tidligere rapportert den vedvarende kasteren av VZV i spytt på 67% av Hz individer fra 3 måneder til 12 år etter Hz uten tilstedeværelse av utslett.56 Dermed kan forhøyningene av eksosomale risikofaktorproteiner hos Hz individer skyldes ufullstendig nedleggelse av virus. Vi forventer at disse risikofaktorproteinene skal toppes omtrent 3 måneder etter Hz, og deretter avta ved 6- og 12-måneders etter-Hz fordi en studie av VZV vaskulopati individer viste gjennomsnittlig tid fra Hz til hjerneslag er omtrent 4 måneder.57 I tillegg, gitt at hjerneslagrisikoen er høyest for personer med HZO, vil 10 vi forventer at eksosomer fra HZO -individer vil ha det høyeste nivået av risikofaktorproteiner blant alle Hz individer. Som forutsagt i våre foreløpige studier, forventer vi ikke å finne virale proteiner eller cytokiner i eksosomene til kontroll- og HZ -individer.

Når det gjelder RNA -sekvensering av Hz -eksosomer, forventer vi ikke å se noen virale transkripsjoner fordi VZV DNA og RNA sjelden blir oppdaget under Hz (personlig kommunikasjon, professor Ravi Mahalingam). Vi forventer å oppdage endringer i miRNAer som er implisert i cerebro- og hjerte- og karsykdommer som miR-221 og miR-222 som er forhøyet hos individer med vaskulær sykdom, 73 miR-143, som er en viktig formidler av lungearteriell hypertensjon, 74 og miR-31 som øker med lungespenning i vaskulært glatt glatt. Interessant nok viste en foreløpig studie i vårt laboratorium den betydelige forhøyelsen av disse miRNAene i eksosomer av VZV-infiserte sensoriske nevroner sammenlignet med eksosomer fra spotte infiserte nevroner (fig. 2). Til slutt forventer vi at APOE4 bærer individer vil ha de mest robuste og vedvarende risikofaktorproteiner/miRNA i deres sirkulerende eksosomer gitt ApoE4 er en kjent risikofaktor for vaskulær demens.67-69

Mål 2. Bestem mekanismen (e) der ikke-smittsomme Hz-eksosomer fremmer vaskulær dysfunksjon.

Forventede resultater og tolkninger: Våre pilotcytokinstudier viste en økning i produksjonen av IL-6 og IL-8 fra HBVAF-er (som er viktige regulatorer for betennelse og vaskulær veggstruktur og funksjon) etter eksponering for Hz-eksosomer sammenlignet med kontroller (fig. 3) .2 Vi spår at dette vil fortsette å være tilfelle med en større prøvestørrelse og forekomme i VEC -ene. Vi antar at disse cytokinene og ROS-produksjonen vil toppe på 1- og 3-måneders tidspunkter. For de fleste individer antar vi evnen til å indusere betennelse og ROS i naive celler vil avta med 12 måneder etter Hz, men APOE4 som bærer VEC vil trolig forbli hyperpå-inflammatoriske. Vi har også gjennomført denne analysen ved bruk av eksosomer avledet fra mock- eller VZV-infiserte humane sensoriske nevroner in vitro. Sammenlignet med hånlige eksosomer, brukes VZV-kondisjonerte eksosomer (som ikke er infeksjonslige) på naive HBVAF-er betydelig økt sekresjon av IL-6, IL-8 og IL-1β; Derfor mistenker vi at eksosomene som utløser inflammatorisk cytokinproduksjon stammer fra VZV-infiserte celler. Gitt at vi ser en langvarig forhøyning av Hz-eksosomer som inneholder forhøyede risikofaktorproteiner, og disse Hz-eksosomene kan fremdeles indusere IL-6 og IL-8 3 måneder etter HZ2 antyder at det er pågående viral replikasjon i (en undergruppe eller alle) HZ-pasienter godt etter at utslett har blitt ryddet. Som nevnt ovenfor, viste gruppen vår aktiv VZV -kasting i spytt av HZ -pasienter opptil 12 år etter godkjenning av utslett.40 Vi spår også å observere amyloidavsetning i celler utsatt for Hz -eksosomer, men ikke kontroller, og at denne effekten vil være mest fremtredende i APOE4 som bærer VEC -er. Endelig vil immunofluorescerende farging sannsynligvis vise en reduksjon i tett kryssfarging i Hz utsatte VEC-er som indikerer en forstyrrelse av blod-hjerne-barrier-integritet. Vi tror de patogene prosessene delvis skyldes den forhøyede belastningen av THBS1 i Hz -eksosomer og at å blokkere aktiviteten til THBS1 vil dempe disse effektene.

Basert på vår pilotstudie, forventer vi at vi ser en økning i blodplateaktivering målt ved en økning i blodplater som uttrykker P-selectin og fosfatidylserin etter eksponering for Hz-eksosomer, men ikke kontrollerer eksosomer. Videre spår vi at dette aktiveringsmønsteret fortsatt vil være fremtredende på det 3-måneders tidspunktet som indikerer en vedvarende risiko for hjerneslag, i samsvar med epidemiologiske data; 20% eksosomeksponering fra Hz -prøver vil sannsynligvis ha et mer uttalt aktiveringsmønster enn 10%. Vi forventer at aktiveringsmønsteret 12 måneder etter Hz vil bli redusert og ikke vesentlig forskjellig fra kontrolleksosomer. Tilsvarende regner vi med å se en økning i hastighet og mengde blodplate og fibrinakkumulering i mikrofluidiske modeller av blodplater utsatt for Hz -eksosomer sammenlignet med blodplater utsatt for kontrolleksosomer. Vi forventer at CD36-hemmeren vil dempe Hz eksosominduserte effekter på blodplatefunksjonen, som vil gi sterke mekanistiske bevis. Ved å bruke flere metodologier for å teste blodplateaktivering, aggregering og funksjon, samt induksjon av proinflammatorisk cytokin, ROS og amyloidproduksjon av HBVAF -er og VEC, vil vi generere en omfattende funksjonell profil for Hz -eksosomer ved forskjellige tidspunkter gjennom sykdommen. Resultater fra disse studiene vil ha kritiske implikasjoner for klinisk praksis og hvordan vi tenker på VZV -reaktivering generelt. Spesifikt, hvis Hz-eksosomer er vist å være patologisk aktive og gi en funksjonell økt risiko for hjerneslag og vaskulær dysfunksjon, som våre foreløpige data antyder, er lengre antiviral behandling og/eller anti-platelet-terapier garantert. Til slutt er det sannsynlig at vi vil identifisere spesifikke proteiner i eksosomene via massespektrometri (i mål 1) som vil korrelere med de funksjonelle/mekanistiske analysene foreslått i AIM 2. Dette kan gi ytterligere terapeutiske intervensjonelle mål og forhåndsdata for fremtidige knock-down-eksperimenter der eksosomproteiner av interesse er blokkert om å se om plattlettingen er vikt.