상변연각결막염의 병인

1. 표본 수집:

   우리는 표본을 서로 다른 두 부분으로 수집할 것입니다. 한 부분은 SLK 환자의 모든 파라핀 블록을 수집하여 병리과에서 각 파라핀 블록의 5-μm 섹션의 15개 사본을 얻는 것입니다. 추가 면역조직화학(IHC) 염색을 위해 모든 슬라이드를 탈파라핀화하고 재수화합니다. IHC 염색에 대한 1차 항체에는 케모카인 수용체(CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR1. CCR3, CCR4, CCR5, CD30L) 및 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP-1, -2, -3, -9).

   이 연구의 또 다른 부분은 SLK 환자와 정상 대조군 환자의 결막을 수집하는 것입니다. 임상 연구의 이 부분은 동시에 IRB 승인을 위해 전송됩니다. 결막절제술을 받은 SLK 환자의 결막을 향후 1년 안에 치료로 수집할 예정이다. 그리고 백내장 수술이나 망막 수술을 받기 위해 우리 병원에 내원하는 동안 정상 대조 결막을 얻어 결막이 남아있는 것을 확인합니다. 신선한 결막은 RNA 분리 전 -80℃에서 보관됩니다. 모든 조직은 RNA로 처리되고 cDNA로 역전사됩니다. 중합 효소 연쇄 반응은 CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR1, CCR3, CCR4, CCR5 및 CD30L을 포함한 프라이머로 수행됩니다.

2. RNA 및 cDNA의 준비:

   Trizol 시약(Life, Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 SLK 및 대조군의 결막에서 총 RNA를 추출합니다. 각 샘플의 총 RNA 1마이크로그램을 500ng 올리고(dT)(Fermentas, Hanover, MD, USA)로 70℃에서 5분 동안 어닐링하고 200u RevertAid™ M-MuLV Reverse Transcriptase(Fermentas, Hanover, MD, USA)당 20 μl를 42℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 70℃에서 10분간 가열하면 반응이 정지된다.

3. 중합효소 연쇄 반응(PCR):

   PCR은 인간 케모카인, 케모카인 수용체 및 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)에 대한 특정 프라이머를 사용하여 각 샘플의 결과 cDNA에서 수행됩니다. 증폭은 열순환기로 수행됩니다. 25μl 반응 혼합물은 2μl cDNA, 1μl 센스 및 안티센스 프라이머, 12.5μl 2x PCR 믹스로 구성됩니다. 각각의 케모카인과 케모카인 수용체를 증폭하는 조건은 denaturation은 94℃에서 1분, elongation은 72℃에서 3분이다. 케모카인 및 케모카인 수용체에 대한 어닐링 온도 및 어닐링 주기는 요청된 온도 및 각 특정 프라이머의 적절한 어닐링 주기 수에 맞을 것입니다. 증폭이 끝나면 반응 혼합물을 72℃에서 10분 동안 가열한 다음 4℃로 냉각합니다. ethidium bromide (Sigma, St Louis, MO, USA)가 포함된 2% agarose에서 젤 전기영동을 수행하여 각 PCR 산물의 10 μl 샘플을 분리합니다. 2% 아가로스 젤은 DNA 분자 길이 마커에 대해 자외선 아래에서 분석됩니다. 각 샘플의 내부 통제는 인간 GAPDH입니다.

4. 면역조직세포계측법(IHC):

특히 비만 세포 트립타제, 관련 케모카인, 케모카인 수용체, MMP 및 염증성 사이토카인에 대한 1차 항체의 사전 결정된 최적 희석이 IHC에 사용됩니다. 모든 IHC 염색은 실온에서 수행됩니다. 그런 다음 절편을 크실렌에서 탈파라핀 처리하고 등급이 매겨진 일련의 에탄올 희석액(100, 95, 80 및 60%)에 침지시켜 친수성으로 만듭니다. 모든 슬라이드를 항원 검색 용액(Dako, S3307, SA, USA)에 담그고 10분 동안 오토클레이브합니다. 절편은 염색 결과를 방해할 수 있는 내인성 조직 과산화효소 활성을 억제하기 위해 10분 동안 3% 신선한 H2O2로 켄칭하고 1x PBS로 5분 동안 두 번 헹구었습니다. 절편을 차단 혈청 용액에서 30분 동안 더 배양한 다음 습한 챔버에서 1차 항체와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양합니다. 1x PBS로 5분 동안 두 번 세척한 후 절편을 비오티닐화된 이차 항체 용액과 함께 30분 동안 배양합니다. 양고추냉이 과산화효소-컨쥬게이션된 스트렙타비딘-비오틴 복합체는 이후 섹션에 고르게 퍼지고 30분 동안 배양됩니다. 절편을 1x PBS로 5분 동안 두 번 세척한 다음 디아미노벤지딘(DAB) 페리옥시다제 기질 용액으로 15분 동안 배양한 다음 1x PBS로 세척합니다. 마지막으로 절편을 적절한 양의 헤마톡실린으로 대조염색한 다음 장착합니다.