上边缘角膜结膜炎的发病机制

1. 标本采集：

   我们将在两个不同的部分收集标本。 一部分是收集所有SLK患者的石蜡块，从病理科获得每个石蜡块的5μm切片15份。 所有载玻片都将脱石蜡和再水化以进行进一步的免疫组织化学 (IHC) 染色。 IHC 染色的一抗包括趋化因子受体（CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CCR1。 CCR3、CCR4、CCR5、CD30L) 和基质金属蛋白酶（MMP-1、-2、-3、-9）。

   本研究的另一部分是收集 SLK 患者和正常对照患者的结膜。 这部分临床研究同时送交 IRB 批准。 我们将收集 SLK 患者在接下来的一年内接受结膜切除术时的结膜作为治疗。 来我院行白内障手术或视网膜手术，经腹膜切开术发现多余结膜者，取正常对照结膜。 新鲜结膜在RNA分离前保存于-80℃。 所有组织将被加工成 RNA 并逆转录成 cDNA。 聚合酶链反应将用引物完成，包括 CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CCR1、CCR3、CCR4、CCR5 和 CD30L。

2. RNA和cDNA的制备：

   使用 Trizol 试剂（Life, Gaithersburg, MD, USA）从 SLK 和对照组的结膜中提取总 RNA。 来自每个样品的 1 微克总 RNA 将在 70℃ 下与 500 ng oligo(dT)（Fermentas，Hanover，MD，USA）退火 5 分钟，并通过 200u RevertAid™ M-MuLV 逆转录酶（Fermentas， Hanover, MD, USA) 每 20 µl 反应 42℃ 1 小时。 70℃加热10分钟终止反应。

3. 聚合酶链式反应 (PCR)：

   将使用针对人趋化因子、趋化因子受体和甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) 的特异性引物对来自每个样品的所得 cDNA 进行 PCR。 扩增将用热循环仪进行。 25 μl 反应混合物包含 2 μl cDNA、1 μl 正义和反义引物、12.5 μl 2x PCR 混合物。 各趋化因子和趋化因子受体的扩增条件如下：变性94℃1分钟，延伸72℃3分钟。 趋化因子和趋化因子受体的退火温度和退火循环将符合要求的温度和每个特定引物的适当退火循环数。 扩增结束时，将反应混合物在72℃加热10分钟，然后冷却至4℃。 通过在含有溴化乙锭的 2% 琼脂糖 (Sigma, St Louis, MO, USA) 上进行凝胶电泳，分离每个 PCR 产物的 10 μl 样品。 2% 的琼脂糖凝胶将在紫外线下针对 DNA 分子长度标记进行分析。 每个样品的内部对照是人 GAPDH。

4. 免疫组织细胞术 (IHC)：

预先确定的最佳稀释一抗特异性针对肥大细胞类胰蛋白酶、相关趋化因子、趋化因子受体、MMP 和炎性细胞因子将用于 IHC。 所有 IHC 染色都将在室温下进行。 然后将切片在二甲苯中脱蜡，并通过浸入一系列分级的乙醇稀释液（100%、95%、80% 和 60%）中使其具有亲水性。 将所有载玻片浸入抗原修复溶液（Dako，S3307，SA，USA）中并高压灭菌 10 分钟。 切片用 3% 新鲜 H2O2 淬火 10 分钟以抑制可能干扰染色结果的内源性组织过氧化物酶活性，并用 1x PBS 冲洗两次 5 分钟。 切片进一步在封闭血清溶液中孵育 30 分钟，然后在潮湿箱中与一抗在 37℃孵育 1 小时。 用 1x PBS 洗涤两次 5 分钟后，将切片与生物素化二抗溶液一起孵育 30 分钟。 随后将辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素-生物素复合物均匀分布在切片上并孵育 30 分钟。 切片用 1x PBS 洗涤 5 分钟两次，然后用二氨基联苯胺 (DAB) 过氧化物酶底物溶液孵育 15 分钟，然后用 1x PBS 洗涤。 最后，切片用足量的苏木精复染，然后封片。