La patogenesi della cheratocongiuntivite limbica superiore

1. Raccolta campioni:

   Raccoglieremo gli esemplari in due parti diverse. Una parte consiste nel raccogliere tutto il blocco paraffinato dei pazienti SLK per ottenere quindici copie della sezione da 5 μm di ciascun blocco paraffinato dal Dipartimento di Patologia. Tutti i vetrini saranno deparaffinati e reidratati per un'ulteriore colorazione immunoistochimica (IHC). Gli anticorpi primari per la colorazione IHC includono i recettori delle chemochine (CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR1. CCR3, CCR4, CCR5, CD30L) e metalloproteinasi di matrice (MMP-1, -2, -3, -9).

   Un'altra parte di questo studio consiste nel raccogliere la congiuntiva dei pazienti SLK e dei pazienti di controllo normali. Questa parte dello studio clinico viene inviata per l'approvazione dell'IRB in concomitanza. Raccoglieremo la congiuntiva dei pazienti con SLK quando riceveranno la resezione congiuntivale come trattamento nell'anno successivo. E la normale congiuntiva di controllo sarà ottenuta mentre i pazienti vengono nel nostro ospedale per la chirurgia della cataratta o la chirurgia della retina con congiuntiva ridondante annotata dopo la peritomia. La congiuntiva fresca verrà conservata a -80 ℃ prima dell'isolamento dell'RNA. Tutto il tessuto sarà processato in RNA e retrotrascritto in cDNA. La reazione a catena della polimerasi sarà eseguita con i primer, inclusi CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR1, CCR3, CCR4, CCR5 e CD30L.

2. Preparazione di RNA e cDNA:

   L'RNA totale sarà estratto dalla congiuntiva di SLK e dai gruppi di controllo con il reagente Trizol (Life, Gaithersburg, MD, USA). Un microgrammo di RNA totale da ciascun campione sarà ricotto per 5 minuti a 70℃ con 500 ng di oligo(dT) (Fermentas, Hannover, MD, USA) e retrotrascritto in cDNA da 200u RevertAid™ M-MuLV Reverse Transcriptase (Fermentas, Hannover, MD, USA) per 20 µl di reazione per 1 ora a 42℃. La reazione sarà fermata riscaldando per 10 min a 70℃.

3. Reazione a catena della polimerasi (PCR):

   La PCR sarà eseguita sul cDNA risultante da ciascun campione con primer specifici per chemochine umane, recettori per chemochine e gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH). L'amplificazione sarà effettuata con un termociclatore. La miscela di reazione da 25 μl è composta da 2 μl di cDNA, 1 μl di primer senso e antisenso, 12,5 μl di miscela PCR 2x. Le condizioni per l'amplificazione di ciascuna chemochina e recettore per chemochine sono le seguenti: denaturazione, 1 min a 94 ℃ e allungamento, 3 min a 72 ℃. La temperatura di ricottura e il ciclo di ricottura per chemochine e recettori per chemochine si adatteranno alla temperatura richiesta e al numero appropriato di cicli di ricottura di ciascun primer specifico. Al termine dell'amplificazione, la miscela di reazione sarà riscaldata per 10 min a 72℃ e poi raffreddata a 4℃. Un campione di 10 μl di ciascun prodotto di PCR sarà separato mediante elettroforesi su gel su agarosio al 2% contenente bromuro di etidio (Sigma, St Louis, MO, USA). Il gel di agarosio al 2% sarà analizzato sotto luce ultravioletta rispetto ai marcatori di lunghezza molecolare del DNA. Il controllo interno di ogni campione è GAPDH umano.

4. Immunoistocitometria (IHC):

Per l'IHC verrà utilizzata una diluizione ottimale predeterminata dell'anticorpo primario specifico contro la triptasi dei mastociti, le chemochine associate, i recettori delle chemochine, le MMP e le citochine infiammatorie. Tutte le colorazioni IHC saranno eseguite a temperatura ambiente. Le sezioni vengono quindi deparaffinate in xilene e rese idrofile mediante immersione in una serie graduata di diluizioni di etanolo (100, 95, 80 e 60%). Tutti i vetrini sono immersi nella soluzione di recupero dell'antigene (Dako ,S3307, SA, USA) e autoclavati per 10 min. Le sezioni vengono spente con H2O2 fresca al 3% per 10 min per inibire l'attività della perossidasi tissutale endogena che potrebbe interferire con il risultato della colorazione e risciacquate con 1x PBS per 5 min due volte. Le sezioni vengono ulteriormente incubate in una soluzione di siero bloccante per 30 min e poi incubate a 37℃ per 1 h con anticorpo primario in una camera umida. Dopo aver lavato due volte con 1x PBS per 5 minuti, le sezioni vengono quindi incubate con una soluzione di anticorpo secondario biotinilato per 30 minuti. Il complesso streptavidina-biotina coniugato con perossidasi di rafano viene successivamente distribuito uniformemente sulle sezioni e incubato per 30 min. Le sezioni vengono lavate con PBS 1x per 5 minuti due volte, quindi incubate con una soluzione di substrato perossidasi diaminobenzidina (DAB) per 15 minuti seguita da lavaggio con PBS 1x. Infine, le sezioni vengono controcolorate con un adeguato volume di ematossilina e quindi montate.