Patogeneza górnego limbicznego zapalenia rogówki i spojówki

1. Kolekcja okazów:

   Okazy będziemy zbierać w dwóch różnych częściach. Jedna część polega na zebraniu wszystkich parafinowanych bloków pacjentów SLK, aby otrzymać piętnaście kopii 5-μm skrawków każdego parafinowanego bloku z Wydziału Patologii. Wszystkie szkiełka zostaną odparafinowane i ponownie uwodnione do dalszego barwienia immunohistochemicznego (IHC). Pierwotne przeciwciała do barwienia IHC obejmują receptory chemokin (CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR1. CCR3, CCR4, CCR5, CD30L) i metaloproteinazy macierzy (MMP-1, -2, -3, -9).

   Inną częścią tego badania jest zebranie spojówek pacjentów z SLK i zdrowych pacjentów kontrolnych. Ta część badania klinicznego jest jednocześnie przesyłana do zatwierdzenia przez IRB. Będziemy zbierać spojówki pacjentów z SLK, gdy będą oni poddani resekcji spojówki jako leczeniu w następnym roku. A normalną kontrolę spojówki uzyskamy w czasie, gdy pacjenci zgłaszają się do naszego szpitala na operację zaćmy lub operację siatkówki ze zbędną spojówką stwierdzoną po peritomii. Świeża spojówka będzie przechowywana w temperaturze -80 ℃ przed izolacją RNA. Cała tkanka zostanie przetworzona w RNA i poddana odwrotnej transkrypcji w cDNA. Reakcja łańcuchowa polimerazy zostanie przeprowadzona ze starterami, w tym CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR1, CCR3, CCR4, CCR5 i CD30L.

2. Przygotowanie RNA i cDNA:

   Całkowity RNA zostanie wyekstrahowany ze spojówek SLK i grup kontrolnych za pomocą odczynnika Trizol (Life, Gaithersburg, MD, USA). Jeden mikrogram całkowitego RNA z każdej próbki będzie poddawany hybrydyzacji przez 5 minut w temperaturze 70°C z 500 ng oligo(dT) (Fermentas, Hanover, MD, USA) i poddawany odwrotnej transkrypcji do cDNA przez 200 u RevertAid™ M-MuLV Reverse Transcriptase (Fermentas, Hanover, MD, USA) na 20 µl reakcji przez 1 godzinę w 42°C. Reakcję zatrzyma się przez ogrzewanie przez 10 minut w temperaturze 70 ℃.

3. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR):

   PCR zostanie przeprowadzony na otrzymanym cDNA z każdej próbki ze specyficznymi starterami dla ludzkich chemokin, receptorów chemokin i dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPDH). Amplifikacja zostanie przeprowadzona za pomocą termocyklera. Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μl składa się z 2 μl cDNA, 1 μl startera sensownego i antysensownego, 12,5 μl mieszaniny 2x PCR. Warunki amplifikacji każdej chemokiny i receptora chemokin są następujące: denaturacja, 1 min w 94°C i wydłużanie, 3 min w 72°C. Temperatura hybrydyzacji i cykl hybrydyzacji dla chemokin i receptorów chemokin będą pasować do żądanej temperatury i odpowiedniej liczby cykli hybrydyzacji każdego specyficznego startera. Pod koniec amplifikacji mieszaninę reakcyjną ogrzewa się przez 10 min w 72℃, a następnie schładza do 4℃. Próbka 10 μl każdego produktu PCR zostanie oddzielona przez przeprowadzenie elektroforezy żelowej na 2% agarozie zawierającej bromek etydyny (Sigma, St Louis, MO, USA). 2% żel agarozowy będzie analizowany w świetle ultrafioletowym pod kątem markerów długości cząsteczek DNA. Kontrolą wewnętrzną każdej próbki jest ludzki GAPDH.

4. Immunohistocytometria (IHC):

Wstępnie określone optymalne rozcieńczenie pierwszorzędowego przeciwciała specyficznie przeciwko tryptazie komórek tucznych, związanym z nią chemokinom, receptorom chemokin, MMP i cytokinom zapalnym zostanie użyte do IHC. Wszystkie barwienia IHC będą wykonywane w temperaturze pokojowej. Skrawki są następnie odparafinowane w ksylenie i uczynione hydrofilowymi przez zanurzenie w stopniowanych seriach rozcieńczeń etanolu (100, 95, 80 i 60%). Wszystkie szkiełka zanurzono w roztworze do odzyskiwania antygenu (Dako, S3307, SA, USA) i autoklawowano przez 10 minut. Skrawki schładza się 3% świeżą H2O2 przez 10 min w celu zahamowania endogennej aktywności peroksydazy tkankowej, która może zakłócać wynik barwienia, i dwukrotnie przemywa 1x PBS przez 5 min. Skrawki dalej inkubuje się w roztworze surowicy blokującej przez 30 minut, a następnie inkubuje w temperaturze 37°C przez 1 godzinę z pierwszorzędowym przeciwciałem w wilgotnej komorze. Po dwukrotnym przemyciu 1x PBS przez 5 min, skrawki następnie inkubuje się z roztworem biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego przez 30 min. Kompleks streptawidyna-biotyna sprzężony z peroksydazą chrzanową jest następnie rozprowadzany równomiernie na skrawkach i inkubowany przez 30 minut. Skrawki przemywa się dwukrotnie 1x PBS przez 5 minut, następnie inkubuje z roztworem substratu peroksydazy diaminobenzydyny (DAB) przez 15 minut, a następnie przemywa 1x PBS. Na koniec skrawki są barwione kontrastowo odpowiednią objętością hematoksyliny, a następnie montowane.