A felső limbikus keratoconjunctivitis patogenezise

1. Mintagyűjtemény:

   A mintákat két különböző részre gyűjtjük. Az egyik rész az SLK-betegek összes paraffinizált blokkjának összegyűjtése, hogy minden paraffinizált blokk 5 μm-es metszetéből tizenöt másolatot kapjunk a Patológiai Osztálytól. Az összes tárgylemezt paraffinmentesítjük és rehidratáljuk a további immunhisztokémiai (IHC) festéshez. Az IHC festéssel szembeni elsődleges antitestek közé tartoznak a kemokin receptorok (CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR1). CCR3, CCR4, CCR5, CD30L) és mátrix metalloproteinázok (MMP-1, -2, -3, -9).

   A vizsgálat másik része az SLK-betegek és a normál kontroll betegek kötőhártyájának összegyűjtése. A klinikai vizsgálat ezen részét egyidejűleg elküldik IRB jóváhagyásra. Az SLK-s betegek kötőhártyáját akkor gyűjtjük, amikor kezelésként kötőhártya-reszekciót kapnak a következő egy évben. És a normál kontroll kötőhártya megszerzésére kerül sor, amíg a betegek szürkehályog-műtétre vagy retinaműtétre jönnek kórházunkba hashártya műtét után redundáns kötőhártyával. A friss kötőhártyát -80 ℃-on tárolják az RNS izolálása előtt. Az összes szövetet RNS-vé dolgozzák fel, és reverz transzkripcióját cDNS-sé. A polimeráz láncreakciót a primerekkel hajtják végre, beleértve a CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR1, CCR3, CCR4, CCR5 és CD30L primereket.

2. RNS és cDNS előállítása:

   A teljes RNS-t az SLK és a kontrollcsoportok kötőhártyájából vonják ki Trizol reagenssel (Life, Gaithersburg, MD, USA). Minden mintából 1 mikrogramm teljes RNS-t 5 percig 70 °C-on 500 ng oligo(dT)-vel (Fermentas, Hannover, MD, USA), majd 200u RevertAid™ M-MuLV reverz transzkriptázzal (Fermentas, Hannover, MD, USA) per 20 µl reakciót 1 órán át 42 °C-on. A reakciót 10 percig 70 °C-on történő melegítéssel állítjuk le.

3. Polimeráz láncreakció (PCR):

   Az egyes mintákból származó cDNS-en PCR-t kell végrehajtani humán kemokinekre, kemokinreceptorokra és glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenázra (GAPDH) specifikus primerekkel. Az amplifikáció termociklerrel történik. A 25 μl-es reakcióelegy 2 μl cDNS-ből, 1 μl szensz és antiszensz primerből, 12,5 μl 2x PCR keverékből áll. Az egyes kemokinek és kemokinreceptorok amplifikációjának feltételei a következők: denaturáció, 1 perc 94 °C-on, és elongáció, 3 perc 72 °C-on. A kemokinek és kemokinreceptorok összekapcsolási hőmérséklete és az annealing ciklusa illeszkedik a kívánt hőmérséklethez és az egyes specifikus primerek megfelelő számú összekapcsolási ciklusához. Az amplifikáció végén a reakcióelegyet 10 percig 72 °C-on melegítjük, majd 4 °C-ra hűtjük. Mindegyik PCR-termékből 10 μl-es mintát választunk el gélelektroforézissel 2% agaróz tartalmú etidium-bromiddal (Sigma, St Louis, MO, USA). A 2%-os agaróz gélt ultraibolya fényben elemezzük a DNS molekulahossz markerekkel szemben. Az egyes minták belső kontrollja humán GAPDH.

4. Immunhisztocitometria (IHC):

A specifikusan hízósejt-triptáz, a kapcsolódó kemokinek, kemokin receptorok, MMP-k és gyulladásos citokinek elleni primer antitest előre meghatározott optimális hígítását fogják használni az IHC-hez. Minden IHC-festés szobahőmérsékleten történik. A metszeteket ezután xilolban paraffinmentesítjük, és etanolos hígítások (100, 95, 80 és 60%-os) fokozatos sorozatába merítve hidrofilré teszik. Minden tárgylemezt antigén-visszakereső oldatba merítünk (Dako, S3307, SA, USA), és 10 percig autoklávozzuk. A metszeteket 3%-os friss H2O2-vel 10 percig lehűtjük az endogén szöveti peroxidáz aktivitás gátlására, amely zavarhatja a festés eredményét, majd kétszer 5 percig 1x PBS-sel öblítjük. A metszeteket tovább inkubáljuk blokkoló szérumoldatban 30 percig, majd 37 ℃-on 1 órán át primer antitesttel egy nedves kamrában. Miután kétszer 5 percig 1x PBS-sel mostuk, majd a metszeteket biotinilált másodlagos antitest oldattal inkubáljuk 30 percig. A torma-peroxidázzal konjugált sztreptavidin-biotin komplexet ezt követően egyenletesen eloszlatjuk a metszeteken, és 30 percig inkubáljuk. A metszeteket kétszer 5 percig mossuk 1 x PBS-sel, majd 15 percig diaminobenzidin (DAB) perioxidáz szubsztrát oldattal inkubáljuk, majd 1 x PBS-sel mossuk. Végül a metszetet megfelelő mennyiségű hematoxilinnel ellenfestjük, majd felszereljük.