Patogeneze horní limbické keratokonjunktivitidy

1. Sbírka vzorků:

   Budeme shromažďovat vzorky ve dvou různých částech. Součástí je shromáždit všechny parafinizované bloky pacientů SLK, abychom získali patnáct kopií 5μm řezu každého parafinovaného bloku z Ústavu patologie. Všechna sklíčka budou zbavena parafinu a rehydratována pro další imunohistochemické (IHC) barvení. Primární protilátky pro IHC barvení zahrnují chemokinové receptory (CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR1. CCR3, CCR4, CCR5, CD30L) a matricové metaloproteinázy (MMP-1, -2, -3, -9).

   Další částí této studie je sběr spojivek pacientů se SLK a normálních kontrolních pacientů. Tato část klinické studie je odeslána ke schválení IRB současně. U pacientů se SLK odebereme spojivku při resekci spojivky jako léčbě v následujícím roce. A normální kontrolní spojivka bude získána, zatímco pacienti přijdou do naší nemocnice na operaci šedého zákalu nebo operaci sítnice s nadbytečnou spojivkou zaznamenanou po peritomii. Čerstvá spojivka bude před izolací RNA skladována při -80 °C. Veškerá tkáň bude zpracována na RNA a reverzně přepsána na cDNA. Polymerázová řetězová reakce bude provedena s primery, včetně CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR1, CCR3, CCR4, CCR5 a CD30L.

2. Příprava RNA a cDNA:

   Celková RNA bude extrahována ze spojivky SLK a kontrolních skupin pomocí činidla Trizol (Life, Gaithersburg, MD, USA). Jeden mikrogram celkové RNA z každého vzorku bude žíhán po dobu 5 minut při 70 °C s 500 ng oligo(dT) (Fermentas, Hanover, MD, USA) a reverzně transkribován na cDNA pomocí 200u RevertAid™ M-MuLV reverzní transkriptázy (Fermentas, Hanover, MD, USA) na 20 ul reakce po dobu 1 hodiny při 42 °C. Reakce se zastaví zahříváním po dobu 10 minut na 70 °C.

3. Polymerázová řetězová reakce (PCR):

   PCR bude provedena na výsledné cDNA z každého vzorku se specifickými primery pro lidské chemokiny, chemokinové receptory a glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu (GAPDH). Amplifikace bude provedena termocyklerem. 25 μl reakční směsi se skládá z 2 μl cDNA, 1 μl sense a antisense primeru, 12,5 μl 2x PCR mix. Podmínky pro amplifikaci každého chemokinu a chemokinového receptoru jsou následující: denaturace, 1 minuta při 94 °C, a elongace, 3 minuty při 72 °C. Teplota nasedání a cyklus nasedání pro chemokiny a chemokinové receptory budou odpovídat požadované teplotě a příslušnému počtu cyklů nasedání každého specifického primeru. Na konci amplifikace se reakční směs zahřívá 10 minut na 72 °C a poté se ochladí na 4 °C. Vzorek 10 μl každého produktu PCR bude separován provedením gelové elektroforézy na 2% agaróze obsahující ethidium bromid (Sigma, St Louis, MO, USA). 2% agarózový gel bude analyzován pod ultrafialovým světlem proti markerům molekulové délky DNA. Vnitřní kontrolou každého vzorku je lidský GAPDH.

4. Imunohistocytometrie (IHC):

Pro IHC bude použito předem stanovené optimální ředění primární protilátky specificky proti tryptáze žírných buněk, asociovaným chemokinům, chemokinovým receptorům, MMP a zánětlivým cytokinům. Veškeré IHC barvení bude prováděno při pokojové teplotě. Řezy jsou poté zbaveny parafinu v xylenu a hydrofilizovány ponořením do stupňované série ředění ethanolu (100, 95, 80 a 60 %). Všechna sklíčka jsou ponořena do roztoku pro vyhledávání antigenu (Dako, S3307, SA, USA) a autoklávována po dobu 10 minut. Řezy se ztlumí 3% čerstvou H2O2 po dobu 10 minut, aby se inhibovala aktivita endogenní tkáňové peroxidázy, která by mohla interferovat s výsledkem barvení, a dvakrát se promyjí 1x PBS po dobu 5 minut. Řezy se dále inkubují v roztoku blokujícího séra po dobu 30 minut a poté se inkubují při 37 °C po dobu 1 hodiny s primární protilátkou ve vlhké komoře. Po promytí 1x PBS dvakrát po dobu 5 minut se řezy inkubují s roztokem biotinylované sekundární protilátky po dobu 30 minut. Komplex streptavidin-biotin konjugovaný s křenovou peroxidázou se následně rovnoměrně rozprostře po řezech a inkubuje po dobu 30 minut. Řezy se dvakrát promyjí 1x PBS po dobu 5 minut, poté se inkubují s roztokem substrátu diaminobenzidin (DAB) perioxidázy po dobu 15 minut a následně se promyjí 1x PBS. Nakonec se řezy kontrastně obarví odpovídajícím objemem hematoxylinu a poté se namontují.