上辺縁系角結膜炎の病因

1. 標本コレクション:

   標本を 2 つの異なる部分に収集します。 1 つの部分は、SLK 患者のすべてのパラフィン化ブロックを収集して、病理学科から各パラフィン化ブロックの 5 μm セクションの 15 のコピーを取得することです。 すべてのスライドは、さらなる免疫組織化学（IHC）染色のために脱パラフィンおよび再水和されます。 IHC 染色用の一次抗体には、ケモカイン受容体 (CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CCR1. CCR3、CCR4、CCR5、CD30L) およびマトリックスメタロプロテイナーゼ (MMP-1、-2、-3、-9)。

   この研究のもう 1 つの部分は、SLK 患者と正常な対照患者の結膜を収集することです。 臨床研究のこの部分は、IRB の承認のために同時に送られます。 SLK患者さんは、1年後の治療として結膜切除を受ける際に結膜を採取します。 また、患者が白内障手術または網膜手術のために当院に来る間、正常なコントロール結膜が得られます。 新鮮な結膜は RNA 分離前に -80℃ で保存されます。 すべての組織は RNA に処理され、cDNA に逆転写されます。 ポリメラーゼ連鎖反応は、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CCR1、CCR3、CCR4、CCR5、および CD30L を含むプライマーで行われます。

2. RNA および cDNA の調製:

   Trizol試薬（Life、Gaithersburg、MD、USA）を使用して、SLKおよびコントロールグループの結膜から全RNAを抽出します。 各サンプルからの 1 μg の全 RNA を 500 ng の oligo(dT) (Fermentas, Hanover, MD, USA) で 70℃ で 5 分間アニールし、200u RevertAid™ M-MuLV Reverse Transcriptase (Fermentas,ハノーバー、メリーランド州、米国) 42℃で 1 時間、20 μl 反応あたり。 反応は 70℃で 10 分間加熱することにより停止します。

3. ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR):

   PCRは、ヒトケモカイン、ケモカイン受容体、およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）に特異的なプライマーを用いて、各サンプルから得られたcDNAに対して実施されます。 増幅は、サーモサイクラーで実行されます。 25 μl の反応混合物は、2 μl の cDNA、1 μl のセンスおよびアンチセンス プライマー、12.5 μl の 2x PCR ミックスで構成されます。 各ケモカインおよびケモカイン受容体の増幅条件は、変性94℃1分、伸長72℃3分です。 ケモカインとケモカイン受容体のアニーリング温度とアニーリング サイクルは、要求された温度と各特定のプライマーの適切なアニーリング サイクル数に適合します。 増幅が終了したら、反応混合物を 72℃で 10 分間加熱し、その後 4℃に冷却します。 各 PCR 産物の 10 μl サンプルを、臭化エチジウムを含む 2% アガロース (Sigma, St Louis, MO, USA) でゲル電気泳動を行うことにより分離します。 2% アガロースゲルは、DNA 分子長マーカーに対して紫外線下で分析されます。 各サンプルの内部コントロールは、ヒト GAPDH です。

4. 免疫組織サイトメトリー (IHC):

マスト細胞トリプターゼ、関連ケモカイン、ケモカイン受容体、MMP、および炎症性サイトカインに特異的な一次抗体の事前に決定された最適な希釈が IHC に使用されます。 すべての IHC 染色は室温で行います。 次に、切片をキシレンで脱パラフィンし、一連の段階的なエタノール希釈液 (100、95、80、および 60%) に浸漬して親水性にします。 すべてのスライドを抗原回復溶液 (Dako、S3307、SA、USA) に浸し、10 分間オートクレーブします。 切片を 3% の新鮮な H2O2 で 10 分間クエンチして、染色の結果を妨げる可能性のある内因性組織のペルオキシダーゼ活性を阻害し、1x PBS で 5 分間 2 回リンスします。 切片をブロッキング血清溶液でさらに 30 分間インキュベートし、湿潤チャンバー内で一次抗体とともに 37℃で 1 時間インキュベートします。 1x PBS で 5 分間 2 回洗浄した後、切片をビオチン化二次抗体溶液で 30 分間インキュベートします。 西洋わさびペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン-ビオチン複合体は、その後、セクション全体に均等に広がり、30分間インキュベートされます。 切片を 1x PBS で 5 分間 2 回洗浄し、ジアミノベンジジン (DAB) ペリオキシダーゼ基質溶液で 15 分間インキュベートし、続いて 1x PBS で洗浄します。 最後に、切片を十分な量のヘマトキシリンで対比染色し、マウントします。