Die Pathogenese der oberen limbischen Keratokonjunktivitis

1. Probensammlung:

   Wir werden die Proben in zwei verschiedenen Teilen sammeln. Ein Teil besteht darin, alle paraffinisierten Blöcke der SLK-Patienten zu sammeln, um fünfzehn Kopien von 5-μm-Schnitten jedes paraffinisierten Blocks von der Abteilung für Pathologie zu erhalten. Alle Objektträger werden entparaffiniert und zur weiteren immunhistochemischen (IHC) Färbung rehydriert . Zu den primären Antikörpern für die IHC-Färbung gehören Chemokinrezeptoren (CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR1. CCR3, CCR4, CCR5, CD30L) und Matrixmetalloproteinasen (MMP-1, -2, -3, -9).

   Ein weiterer Teil dieser Studie besteht darin, die Bindehaut von SLK-Patienten und normalen Kontrollpatienten zu sammeln. Dieser Teil der klinischen Studie wird gleichzeitig zur IRB-Genehmigung geschickt. Wir werden die Bindehaut von SLK-Patienten sammeln, wenn sie im folgenden Jahr eine Bindehautresektion als Behandlung erhalten. Und die normale Kontrollkonjunktiva wird erhalten, während die Patienten in unser Krankenhaus kommen, um eine Kataraktoperation oder eine Netzhautoperation mit redundanter Konjunktiva nach Peritomie durchzuführen. Die frische Bindehaut wird vor der RNA-Isolierung bei -80 °C gelagert. Das gesamte Gewebe wird zu RNA verarbeitet und in cDNA revers transkribiert. Die Polymerase-Kettenreaktion wird mit den Primern durchgeführt, einschließlich CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR1, CCR3, CCR4, CCR5 und CD30L.

2. Präparation von RNA und cDNA:

   Gesamt-RNA wird aus der Bindehaut von SLK und Kontrollgruppen mit Trizol-Reagenz (Life, Gaithersburg, MD, USA) extrahiert. Ein Mikrogramm Gesamt-RNA aus jeder Probe wird für 5 min bei 70 °C mit 500 ng Oligo(dT) (Fermentas, Hannover, MD, USA) angelagert und durch 200 u RevertAid™ M-MuLV Reverse Transcriptase (Fermentas, Hannover, MD, USA) pro 20 µl Reaktion für 1 Stunde bei 42℃. Die Reaktion wird durch 10-minütiges Erhitzen auf 70 °C gestoppt.

3. Polymerase-Kettenreaktion (PCR):

   An der resultierenden cDNA aus jeder Probe wird eine PCR mit spezifischen Primern für menschliche Chemokine, Chemokinrezeptoren und Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) durchgeführt. Die Amplifikation wird mit einem Thermocycler durchgeführt. Das 25-μl-Reaktionsgemisch besteht aus 2 μl cDNA, 1 μl Sense- und Antisense-Primer, 12,5 μl 2x PCR-Mix. Die Bedingungen für die Amplifikation jedes Chemokins und Chemokinrezeptors sind wie folgt: Denaturierung, 1 min bei 94℃ und Elongation, 3 min bei 72℃. Die Anlagerungstemperatur und der Anlagerungszyklus für Chemokine und Chemokinrezeptoren passen zu der geforderten Temperatur und der geeigneten Anzahl an Anlagerungszyklen jedes spezifischen Primers. Am Ende der Amplifikation wird das Reaktionsgemisch 10 min auf 72℃ erhitzt und dann auf 4℃ abgekühlt. Eine 10-μl-Probe jedes PCR-Produkts wird durch Gelelektrophorese auf 2 % Agarose mit Ethidiumbromid (Sigma, St. Louis, MO, USA) getrennt. Das 2%ige Agarosegel wird unter ultraviolettem Licht gegen die DNA-Moleküllängenmarker analysiert. Die interne Kontrolle jeder Probe ist humanes GAPDH.

4. Immunhistozytometrie (IHC):

Für IHC wird eine vorher festgelegte optimale Verdünnung des primären Antikörpers spezifisch gegen Mastzelltryptase, assoziierte Chemokine, Chemokinrezeptoren, MMPs und entzündliche Zytokine verwendet. Alle IHC-Färbungen werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Schnitte werden dann in Xylol entparaffiniert und durch Eintauchen in eine abgestufte Reihe von Ethanolverdünnungen (100, 95, 80 und 60 %) hydrophil gemacht. Alle Objektträger werden in Antigen-Rückgewinnungslösung (Dako, S3307, SA, USA) getaucht und 10 Minuten lang autoklaviert. Die Schnitte werden 10 Minuten lang mit 3 % frischem H2O2 abgeschreckt, um die Peroxidaseaktivität des endogenen Gewebes zu hemmen, die das Färbeergebnis beeinträchtigen könnte, und zweimal 5 Minuten lang mit 1x PBS gespült. Die Schnitte werden weitere 30 min in Blockierungsserumlösung inkubiert und dann 1 h bei 37℃ mit primärem Antikörper in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit 1x PBS für 5 min werden die Schnitte dann für 30 min mit biotinylierter sekundärer Antikörperlösung inkubiert. Anschließend wird der Meerrettichperoxidase-konjugierte Streptavidin-Biotin-Komplex gleichmäßig auf die Schnitte verteilt und 30 min inkubiert. Die Schnitte werden zweimal 5 min lang mit 1x PBS gewaschen, dann 15 min lang mit Diaminobenzidin (DAB)-Peroxidase-Substratlösung inkubiert, gefolgt von Waschen mit 1x PBS. Schließlich werden die Schnitte mit einer angemessenen Menge Hämatoxylin gegengefärbt und dann montiert.