Patogenesen af ​​Superior Limbic Keratoconjunctivitis

1. Prøvesamling:

   Vi samler prøverne i to forskellige dele. Den ene del er at indsamle alle de paraffiniserede blok af SLK-patienterne for at få femten kopier af 5-μm snit af hver paraffiniseret blok fra patologisk afdeling. Alle objektglassene vil blive afparaffineret og rehydreret for yderligere immunhistokemi (IHC) farvning. Primære antistoffer til IHC-farvning inkluderer kemokinreceptorer (CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR1. CCR3, CCR4, CCR5, CD30L) og matrixmetalloproteinaser (MMP-1, -2, -3, -9).

   En anden del af denne undersøgelse er at indsamle bindehinden hos SLK-patienter og normale kontrolpatienter. Denne del af det kliniske studie sendes samtidig til IRB-godkendelse. Vi vil indsamle bindehinden hos SLK-patienter, når de får konjunktival resektion som behandling i det følgende et år. Og den normale kontrol bindehinde vil blive opnået, mens patienterne kommer til vores hospital for grå stær operation eller nethindekirurgi med overflødig bindehinde noteret efter peritomi. Den friske bindehinde vil blive opbevaret i -80 ℃ før RNA-isolering. Alt væv vil blive bearbejdet til RNA og revers transkripteret til cDNA. Polymerasekædereaktion vil blive udført med primerne, herunder CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR1, CCR3, CCR4, CCR5 og CD30L.

2. Fremstilling af RNA og cDNA:

   Total RNA vil blive ekstraheret fra bindehinden i SLK og kontrolgrupper med Trizol reagens (Life, Gaithersburg, MD, USA). Et mikrogram totalt RNA fra hver prøve vil blive annealet i 5 minutter ved 70 ℃ med 500 ng oligo(dT) (Fermentas, Hanover, MD, USA) og revers transskriberet til cDNA af 200u RevertAid™ M-MuLV revers transkriptase (Fermentas, Hanover, MD, USA) pr. 20 µl reaktion i 1 time ved 42 ℃. Reaktionen standses ved opvarmning i 10 minutter ved 70 ℃.

3. Polymerasekædereaktion (PCR):

   PCR vil blive udført på det resulterende cDNA fra hver prøve med specifikke primere for humane kemokiner, kemokinreceptorer og glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH). Forstærkningen vil blive udført med en termocykler. 25-μl reaktionsblandingen består af 2 μl cDNA, 1 μl sense- og antisense-primer, 12,5 μl 2x PCR-blanding. Betingelser for amplifikation af hver kemokin og kemokinreceptor er som følger: denaturering, 1 min ved 94 ℃ og forlængelse, 3 min ved 72 ℃. Annealingstemperaturen og annealingscyklussen for kemokiner og kemokinreceptorer vil passe til den ønskede temperatur og det passende antal annealingscyklusser for hver specifik primer. Ved afslutningen af ​​amplifikationen vil reaktionsblandingen blive opvarmet i 10 minutter ved 72 ℃ og derefter afkølet til 4 ℃. En 10-μl prøve af hvert PCR-produkt adskilles ved at udføre gelelektroforese på 2% agarose indeholdende ethidiumbromid (Sigma, St. Louis, MO, USA). 2% agarosegelen vil blive analyseret under ultraviolet lys mod DNA-molekyllængdemarkørerne. Den interne kontrol af hver prøve er human GAPDH.

4. Immunhistocytometri (IHC):

En forudbestemt optimal fortynding af det primære antistof specifikt mod mastcelletryptase, associerede kemokiner, kemokinreceptorer, MMP'er og inflammatoriske cytokiner vil blive brugt til IHC. Al IHC-farvning udføres ved stuetemperatur. Sektioner afparaffineres derefter i xylen og gøres hydrofile ved nedsænkning i en gradueret serie af ethanolfortyndinger (100, 95, 80 og 60%). Alle objektglas nedsænkes i antigenhentningsopløsning (Dako, S3307, SA, USA) og autoklaveres i 10 min. Sektioner standses med 3 % frisk H2O2 i 10 minutter for at hæmme endogen vævsperoxidaseaktivitet, der kan interferere med resultatet af farvning, og skylles med 1x PBS i 5 minutter to gange. Sektioner inkuberes yderligere i blokerende serumopløsning i 30 minutter og inkuberes derefter ved 37 ℃ i 1 time med primært antistof i et fugtigt kammer. Efter vask med 1x PBS i 5 minutter to gange inkuberes sektionerne med biotinyleret sekundær antistofopløsning i 30 minutter. Det peberrodsperoxidase-konjugerede streptavidin-biotin-kompleks fordeles efterfølgende jævnt over sektionerne og inkuberes i 30 min. Sektionerne vaskes med 1 x PBS i 5 minutter to gange og inkuberes derefter med diaminobenzidin (DAB) perioxidasesubstratopløsning i 15 minutter efterfulgt af vask med 1 x PBS. Til sidst modfarves sektionen med et passende volumen hæmatoxylin og monteres derefter.