제1형 진성 당뇨병(METHYLDIAB)이 있는 소아 및 청소년의 DNA 메틸화 (METHYLDIAB)

제1형 진성 당뇨병(T1DM)은 잘 연구된 자가면역 질환으로 선택적 베타 세포 손실로 인해 인슐린 결핍을 초래합니다. 환경 및 유전학 요인은 T1DM 발달로 이어지는 유전적으로 민감한 개체에서 복잡한 상호 작용을 하는 것으로 보입니다.

후생유전학은 DNA 메틸화, 히스톤 변형 및 전사 후 조절자 역할을 하는 마이크로 RNA를 통한 DNA 서열 변경에 기인할 수 없는 데옥시리보핵산(DNA) 발현의 유전적 변화를 연구하는 생물학의 새로운 분야입니다.

시토신의 메틸화 - 유전자의 프로모터 영역에 위치한 구아노신 디뉴클레오티드(CpGs)는 전사 및 유전자 발현에 중요한 역할을 하며 DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT)라고 하는 효소를 통해 5' 시토신 위치에서 촉매됩니다.

지금까지 T1DM 소아 환자의 후생유전학에 관한 제한된 수의 연구가 발표되었습니다. 본 연구의 목적은 Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 22 (PTPN-22), Insulin (INS) 및 Human leukocyte antigen G (HLA)와 같은 특정 감수성 유전자의 프로모터 영역에서 CpG 섬 메틸화 패턴을 조사하는 것이다. -G) T1DM의 백혈구(WBC)에서 추출한 유전자 및 건강한 대조군 어린이 및 청소년.

20명의 환자와 20명의 연령 및 성별 일치 대조군이 모집되었습니다. 상세한 개인, 가족, 임신/주산기 이력을 얻었고 모든 연구 참여자에게 철저한 신체 검사를 실시했습니다. 두 그룹과 1학년 친척 모두 다른 자가면역 질환의 병력이 없었습니다.

연구를 위한 헬싱키 선언에 따라 부모는 자녀의 참여에 대해 서면 동의서를 제공했습니다. 인간 과목을 포함합니다.

프로토콜은 그리스 테살로니키에 있는 테살로니키의 아리스토텔레스 대학교 보건과학부 의과대학 생명윤리위원회의 승인을 받았습니다(프로토콜 번호 185/30.12.2015).

전혈 샘플은 12시간 금식 후 두 그룹 모두에서 수집되었고 즉시 -80 oC에 보관되었습니다.

DNA 추출 키트 QIAamp® DNA Blood Mini Kit(QIAGEN Inc, CA, USA)를 사용하여 제조업체에서 제안한 대로 혈액 샘플에서 DNA를 추출했습니다. 분리된 샘플은 교차비(OD 비율) 260/280(1 OD = 50 μg/ml), (BioPhotometer 6131 Eppendorf AG, Germany)를 사용하여 분광광도계로 정량화되었습니다. Bisulfite 처리는 EZ DNA Methylation-Gold 키트(Zymo Research, Methylation-Gold, USA)를 사용하여 각 샘플의 300ng DNA에 대해 제조업체에서 권장하는 대로 수행했습니다. 중황산나트륨으로 처리하면 메틸화되지 않은 시토신이 우라실로 전환되는 반면, 메틸화 시토신은 동일한 안정한 조건에서 변하지 않은 상태로 유지됩니다.

INS 유전자 프로모터 증폭을 위해 유전자 특이적 프라이머를 다음과 같이 사용하였다: INS-Forward 5'-TATTTTGGAATTTTGAGTTTATT-3' 및 INS-Reverse 5'-AACAAAAATCTAAAAACAACAA-3', for PTPN-22-Forward 5'-TTTTGGTTTATGTTGTAGAGT -3΄ 및 PTPN-22 역방향 5΄- ATTTTATTTTATTATTTATATGTAA-3' 및 HLA-G- 정방향 5'-TAGGGAGTTTAGTTTAGGGAT -3' 및 역방향 5'- TTAAGGATGGTGGTTATGG -3'.

또한 NGS(Next Generation Sequencing) 라이브러리의 신속한 구성을 위해 오버행 어댑터 서열을 표적으로 삼을 영역(Nextera Transposase Adaptors, Illumina)의 유전자좌 특이적 프라이머에 추가했습니다. PCR(Polymerase Chain Reaction) 제품은 AmpliTaq Gold DNA Polymerase를 사용하여 저온 램핑 기기인 9700 열 순환기(Eppendorf AG No5341, 9600 에뮬레이션 모드)에서 증폭되었습니다.

PCR 산물을 고반응성 초자기 비드로 정제한 후 NucleoMag NGS Clean-up 및 Size Select(Macherey-Nagel. 고양이. 번호 744970.5.), 비슷한 몰량으로 풀링하고 제조업체 지침, Nextera XT DNA 라이브러리 준비 키트, Research Illumina에 따라 라이브러리 구축을 위해 제출했습니다.

NGS의 경우 쌍방향 읽기는 플랫폼 Illumina의 MiSeq에서 2 x 250 염기쌍 읽기 길이 형식으로 선택되었습니다.

서열 분석 판독은 FASTQ 파일을 사용하여 수행되었고 메틸화 상태는 도구 ampliMethProfiler(표적화된 심층 중아황산염 서열화 앰플리콘을 위한 파이썬 기반 파이프라인)로 추정되었습니다. 메틸화 상태는 INS 유전자 프로모터의 10개 CpG 사이트, PTPN의 4개 CpG 사이트에서 분석되었습니다. -22개 유전자 및 TSS(transcriptional start site) 주변의 HLA-G 유전자의 19개 CpG 사이트.

메틸화 및 비메틸화 부위의 서열 및 식별은 생물정보학 과학자에 의해 해석될 것입니다.

데이터베이스가 생성되고 모든 데이터는 통계 분석을 거칩니다. 본 연구의 결과 및 결론은 피어 리뷰 저널에 게시되고 국내 및 국제 회의에서 발표됩니다.