치근단 치주염에서 Ca(OH)2의 효과

자격 기준 연구 모집단은 16명의 환자(6명의 여성과 10명의 남성, 19-63세, 평균 연령 34.43세)로 구성되어 이스탄불 메디폴 대학교 치과대학의 근관치료 클리닉에 치근단 치주염 병변이 있는 치아의 비외과적 근관 재치료를 받았습니다. 만성 치근단 치주염 병변의 임상적 및 방사선학적 증거를 나타내는 16개의 이전 근관 치료 치아가 이 연구에 포함되었습니다. 방사선학적으로, periapical radiolucency의 직경은 2~7mm 범위였다. 치료 후 치근단 치주염이 있는 치아는 근관 치료가 2년 이상 일찍 완료되었고 재치료가 필요했습니다. 근관 충전의 종단은 과도하게 충전되지 않고 방사선학적 정점에서 0-4mm 짧은 범위였습니다. 치아는 치근 충전재가 구강에 노출되지 않은 온전한 치관 수복물을 가지고 있었습니다. 선정된 치아는 러버댐으로 적절한 격리를 위한 충분한 크라운 구조를 가지고 있었고 치주낭이나 4mm보다 깊은 부착 레벨이 없었습니다. 제외 기준은 3개월 이내에 항생제를 투여 받았거나 전신 질환이 있는 환자의 치아, 러버댐으로 제대로 격리되지 않은 치아, 관상 봉합이 되지 않은 치아, 치주낭이 있는 치아 등이었다. 깊이 >4 mm; 크라운/치근 골절이 있는 치아. 각 환자의 치아는 하나만 포함되었습니다.

근관 치료 절차 및 샘플링 러버 댐 및 무균 기술이 근관 치료 전반에 걸쳐 사용되었습니다. 플라크 제거 및 러버댐 분리 후 수술 부위를 3% 과산화수소로 세척하고 2.5% NaOCl 용액으로 소독하였다. 그 후, 모든 coronal 수복물, 포스트 및 우식 결손을 제거하고 근관 충전물이 적절하게 노출되면 접근 준비가 완료되었습니다. 그 후, 치아(치수강 포함), 클램프 및 인접한 러버댐을 다시 한 번 2.5% NaOCl로 소독한 다음 세균학적 샘플링에 방해가 되지 않도록 10% 티오황산나트륨으로 불활성화했습니다. 제거 가능한 헤드가 있는 멸균 Omni 면봉(Whatman FTA, Sigma-Aldrich)을 사용하여 치아 표면에서 무균 대조군 샘플(SR1)을 채취했습니다. 페이퍼 포인트는 -20°C에 보관된 인산염 완충 식염수(PBS) 용액이 들어 있는 저온 튜브로 옮겨졌습니다. 각각의 경우에 미생물 평가를 단일 생태 환경으로 제한하기 위해 단일 근관을 샘플링했습니다. 다근 치아에서는 치근단 병변이 있는 치근을 선택하였다. 모든 치근에 치근단 병변이 있는 경우 넓은 근관을 선택하였다. 이 연구에 포함된 근관 중 2개는 단근 치아, 3개는 상악 소구치의 볼관, 1개는 상악 대구치의 구개관, 10개는 하악 대구치의 원위관이었습니다.

Gates-Glidden 드릴(Dentsply Maillefer, Ballaigues, Switzerland)과 화학 용제를 사용하지 않고 근관 파일을 사용하여 오래된 치근 충전물을 제거했습니다. 작업 길이(WL)는 Apex locator(Raypex6; VDW GmbH, Munich, Germany)를 사용하여 apical foramen보다 1mm 짧게 설정한 후 모든 충전재가 제거되었는지 확인하기 위해 periapical 방사선 사진을 촬영했습니다. 샘플을 수집하기 전에 남아 있는 물질을 제거하고 근관을 적시기 위해 멸균 식염수로 세척을 수행했습니다. 다음으로 근관은 식염수로 채워져 있었고 WL에 작은 손 기구를 놓고 근관 벽을 부드럽게 정리하는 데 사용되었습니다. 초기 미생물 샘플(S1)은 WL에 연속적으로 배치된 무균 종이 포인트로 근관에서 채취되었습니다. 샘플링을 위해 3개의 멸균 종이 포인트를 근관에 삽입했습니다. 각 페이퍼 포인트를 근관에 약 1분 동안 두었습니다. 손잡이가 없는 페이퍼 포인트와 근관 손 기구는 모두 -20°C에 보관된 300μL의 PBS 용액이 들어 있는 저온 튜브로 옮겨졌습니다. 콜드 체인에서 추가 분석을 위해 샘플을 유전자 분석 실험실로 옮겼습니다.

근관은 Revo S 파일과 2.5% NaOCl로 다량의 관개를 사용하여 준비되었습니다. 근관은 작동 길이에서 크기 35(AS35)로 정점으로 확대되었습니다. 기구를 교체할 때마다 근관을 5mL의 2.5% NaOCl 용액으로 세척했습니다. 따라서 총 30mL의 관주 용액을 사용했습니다. 계측이 완료된 후 도말층을 17% EDTA로 제거하고 근관에 3분 동안 두었다가 2.5% NaOCl로 제거했습니다. 근관을 멸균 페이퍼 포인트로 건조시키고 NaOCl 용액을 비활성화하기 위해 1분 동안 10% 티오황산나트륨 2mL로 플러싱했습니다. 다음으로, S1에 대해 기술된 바와 같이 근관으로부터 샘플(S2)을 채취하였다. 준비 후, 근관은 연구 그룹에 따라 Ca(OH)2 또는 2% 클로르헥시딘 겔로 치료되었습니다. CH군에서는 ​​수산화칼슘 분말(Calxyl; OCO Products, Dirnstein, Germany)을 식염수와 1:1 비율로 혼합한 후 lentulo spirals(Malleifer-Dentsply)를 이용하여 근관에 페이스트를 삽입하였다. CHX 그룹에서 chlorhexidine 겔 2%(Gluco-Chex 2% 겔, Cerkamed, Stalowa Wola, Polland)를 Ultradent Capillary Tip(Ultradent 제품)을 사용하여 이 그룹의 근관에 넣었습니다. 위의 두 그룹의 모든 근관은 1mm 면 펠렛과 임시 충전재(Cavit G; 3M ESPE AG, Seefeld, Germany)의 최소 3mm 층으로 봉합되었습니다.

7일 후 치아를 분리하고 임시 수복물을 제거하고 수술 부위의 소독 절차를 첫 번째 방문과 동일한 프로토콜에 따라 수행했습니다. 치관과 치수강을 둘러싼 상아질의 새로운 대조군 샘플을 얻었다(SR2). 5mL의 식염수로 약물을 제거하고 마스터 치근단 파일로 근관을 조심스럽게 정리했습니다. Ca(OH)2를 사용하는 군은 0.5% 구연산으로 1분 동안 수산화칼슘 항균 활성을 중화시킨 후 5 mL 식염수로 제거하였다. 따라서 CHX 겔이 있는 그룹의 경우 약물을 0.3% L-α-레시틴과 3% Tween 80의 혼합물로 중화했습니다(Zamany A, Spangberg LS(2002) 클로르헥시딘을 비활성화하는 효과적인 방법. 구강외과, 구강내과, 구강병리과, 구강방사선과, 근관치료). 다음으로, 근관을 2mL의 식염수로 세척하였다. 약제후 샘플(S3)은 약제전 샘플을 수집하고 PCR 분석을 위해 보낸 것과 동일한 방식으로 얻었다.

최종 샘플링 절차 후, 스미어 층은 5mL의 17% EDTA로 세척한 다음 10mL의 증류수로 최종 헹구어 제거했습니다. 근관치료의 마무리는 gutta-percha의 lateral condensation을 이용한 치근충전으로 진행하였다. 복합 레진(Z250, 3M Corporation, Saint Paul, MN, USA)으로 접근 공동을 복원하고 최종 방사선 사진을 촬영했습니다.

장내구균의 양뿐만 아니라 총 박테리아 부하량은 ddPCR을 통해 계측 전, 계측 및 근관내 약제 사용 후 결정되었습니다.

Genomic DNA 분리 및 DNA 농도 측정 QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 제조사에서 권장하는 프로토콜에 따라 DNA를 추출하였다. DNA 분리 전에 샘플(종이 점이 있는 튜브)을 50-60°C에서 10분마다 30초 동안 vortexING하여 분해하여 모든 박테리아를 PBS 용액으로 분해했습니다. 그 후, 종이 점을 현탁액으로부터 무균적으로 제거하고 박테리아 현탁액을 5000g에서 10분 동안 원심분리하여 펠릿화하였다. 그런 다음 펠릿을 QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)에서 공급하는 180µl 버퍼 ATL에 재현탁하고 20µl 프로테이나제 K(20mg/ml)를 첨가했습니다. 샘플을 56°C에서 3시간 동안 배양했습니다. 그 후, QIAamp DNA Mini Kit의 프로토콜에 따라 총 박테리아 게놈 DNA를 분리했습니다. 각 샘플의 DNA 용액의 최종 부피는 150μL였으며 계산 중에 고려되었습니다. DNA 농도(260 nm에서의 흡광도)는 분광광도계(Promega Quantifluor)로 측정했습니다.

16S rRNA 유전자의 증폭 본 연구에서는 Universal 및 Enterococcus 16S rRNA 유전자에 대한 프라이머를 설계했습니다. QIAamp DNA Mini Kit로 샘플의 DNA 추출 후, 범용 E8F 정방향 프라이머(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 및 범용 E1115R 역방향 프라이머(5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3')를 사용하여 700-800 bp의 16S rRNA 염기서열을 증폭했습니다. 59. 각 분리된 박테리아 균주에 대한 PCR 반응의 최종 부피는 25μl로 조정되었습니다. 16S rRNA 유전자의 증폭 반응은 다음과 같은 조건으로 수행하였다. 95°C에서 3분 동안 1주기의 전변성, 95°C에서 30초, 55°C에서 30초 및 72°C에서 30초의 35주기, 72°C에서 10분 동안 최종 확장 단계 계속 .

PCR 산물은 Tris/BoratE/EDTA(TBE) 완충액 내 2% 아가로스 겔(브로마이드 에티듐 함유)을 사용하여 전기영동으로 분석했으며, 젤은 자외선(140V에서 20분 동안)에서 분석했습니다. 그들의 이미지는 자외선 조명 하에서 시각화되었습니다. 또한 ddPCR에 사용할 프라이머의 제어 및 최적화도 기존 PCR에서 수행되었습니다.

16S rRNA Gene의 Purification and sequencing PCR 반응 후, Exonuclease I과 Alkaline Phosphatase 효소를 함유한 ExoSap-IT(Thermo, PN: 78201.1.ML)로 과잉의 primer와 nucleotide를 가수분해하여 PCR product를 정제합니다. 2 μl의 ExoSap-IT를 각 샘플에 대해 5 μl의 PCR 생성물과 혼합했습니다. ExoSap 반응은 37°C에서 15분(효소 활성화)에 이어 80°C에서 15분(비활성화) 수행됩니다. 시퀀싱 반응은 Bigdye™ Terminator v3.1 사이클 시퀀싱 키트(Thermo)를 사용하여 수행되었습니다. 모든 분리된 균주에 대해 키트 매뉴얼에 따라 반응을 수행하였다.

Exosap으로 산물을 정제한 후, BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Thermo)를 사용하여 다음 조건에서 염기서열 반응을 수행하였다. sequence PCR 후 BigDye 제품은 colon method로 정제하였다. Zymo ZR DNA Sequencing Clean-up Kit(Zymo Research, USA)를 사용하였다. 모든 샘플은 키트에 제공된 프로토콜에 따라 정제되었으며 3130XL 유전자 분석기에서 실행되었습니다.

Droplet Digital PCR(ddPCR) Droplet Digital PCR(ddPCR)은 총 박테리아 및 Enterococcus faecalis 종에 특이적인 16S rRNA 영역에 따라 설계된 프라이머를 사용하여 시퀀싱 후 페이퍼 포인트 샘플에서 발견된 박테리아 종의 절대 정량을 수행했습니다. 프라이머 쌍은 총 박테리아에 대해 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' 및 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3이었고 ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCGAGT-3' 및 ENT-R-5'-GCCATGCGGCATAAACTG였습니다. - Enterococcus Faecalis에 대한 3' 프라이머 쌍. PCR 반응에서 마킹되지 않은 프라이머 쌍으로 증폭된 앰플리콘을 Eva-Green 염료로 표지하여 분석했습니다. Enterococcus 및 총 16S rRNA의 절대 정량을 위해 동일한 샘플에서 두 개의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행했습니다. 10µL의 2X ddPCR EvaGreen Supermix(Bio-Rad, cat. 아니요. 1864034), 뉴클레아제가 없는 물 9µL, 정방향 및 역방향 프라이머 모두 0.25µL 및 각 샘플의 DNA 2ng 60ºC에서 1분, 4ºC에서 5분, 90ºC에서 5분 동안 마지막 두 단계, 4ºC 무한 유지. PCR이 완료된 후 밀봉된 플레이트를 QX200 Droplet Reader(Bio-Rad, cat. 아니요. 1864003).