Wpływ Ca(OH)2 na zapalenie przyzębia wierzchołkowego

Kryteria kwalifikacyjne Populacja badana składała się z 16 pacjentów (6 kobiet i 10 mężczyzn, w wieku 19-63 lata, średnia wieku 34,43) zgłaszających się do kliniki endodontycznej w Stambule Medipol University Dental School w celu niechirurgicznego ponownego leczenia endodontycznego zębów ze zmianami zapalnymi przywierzchołków. Do badania włączono szesnaście zębów wcześniej leczonych kanałowo, wykazujących kliniczne i radiologiczne objawy przewlekłego zapalenia przyzębia w wierzchołku. Radiologicznie średnica przezierności okołowierzchołkowej wahała się od 2 do 7 mm. Zęby z pozabiegowym zapaleniem przyzębia wierzchołka miały leczenie endodontyczne zakończone ponad 2 lata wcześniej i wymagały ponownego leczenia. Końce wypełnień kanałów korzeniowych znajdowały się w odległości 0-4 mm od wierzchołka radiologicznego, bez przepełnienia. Zęby miały nienaruszone uzupełnienia koronowe, bez widocznej ekspozycji materiału wypełniającego korzenie na kontakt z jamą ustną. Wybrane zęby miały wystarczającą strukturę korony do odpowiedniej izolacji koferdamem i wykazywały brak kieszonek przyzębnych lub poziomu przyczepu głębszego niż 4 mm. Zastosowano również następujące kryteria wykluczenia: zęby pacjentów, którzy otrzymywali antybiotyki w ciągu ostatnich 3 miesięcy lub którzy mieli jakąkolwiek chorobę ogólną, zęby, których nie można było odpowiednio zaizolować koferdamem, zęby bez uszczelnienia wieńcowego, zęby z kieszonką przyzębną głębokość >4mm; oraz zęby ze złamaniem korony/korzeni. Od każdego pacjenta uwzględniono tylko jeden ząb.

Procedury leczenia kanałowego i pobieranie próbek Koferdam i technika aseptyczna były stosowane przez cały czas ponownego leczenia endodontycznego. Po usunięciu płytki nazębnej i izolacji koferdamu pole operacyjne oczyszczono 3% nadtlenkiem wodoru i zdezynfekowano 2,5% roztworem NaOCl. Następnie usunięto wszystkie uzupełnienia koronowe, wkłady i ubytki próchnicowe oraz zakończono preparację dostępu po prawidłowym odsłonięciu wypełnienia kanału korzeniowego. Następnie ząb (wraz z komorą miazgi), klamrę i przylegający koferdam ponownie zdezynfekowano 2,5% NaOCl, a następnie inaktywowano 10% tiosiarczanem sodu, aby uniknąć interferencji z pobieraniem próbek bakteriologicznych. Próbki kontrolne sterylności (SR1) pobrano z powierzchni zęba sterylnym wacikiem Omni Swab (Whatman FTA, Sigma-Aldrich) z wysuwaną główką. Papierowe ćwieki przeniesiono do krioprobówek zawierających roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przechowywany w temperaturze -20°C. W każdym przypadku pobrano próbkę z pojedynczego kanału korzeniowego, aby ograniczyć ocenę mikrobiologiczną do jednego środowiska ekologicznego. W zębach wielokorzeniowych wybrano korzeń ze zmianą okołowierzchołkową. Jeśli we wszystkich korzeniach występowały zmiany okołowierzchołkowe, wybierano szerszy kanał. Dwa kanały uwzględnione w tym badaniu pochodziły z zębów jednokorzeniowych, 3 kanały policzkowe w zębach przedtrzonowych szczęki, 1 kanał podniebienny w zębach trzonowych szczęki i 10 kanałów dystalnych w zębach trzonowych żuchwy.

Stare wypełnienia korzeni usunięto wiertłami Gates-Glidden (Dentsply Maillefer, Ballaigues, Szwajcaria) i pilnikami endodontycznymi bez użycia rozpuszczalników chemicznych. Długość roboczą (WL) ustalono w odległości 1 mm od otworu wierzchołkowego za pomocą lokalizatora wierzchołka (Raypex6; VDW GmbH, Monachium, Niemcy), a następnie wykonano radiogramy okołowierzchołkowe, aby upewnić się, że usunięto cały materiał wypełniający. Płukanie sterylnym roztworem soli wykonano w celu usunięcia wszelkich pozostałości materiału i zwilżenia kanału przed pobraniem próbki. Następnie kanał pozostawiono wypełniony solą fizjologiczną, a mały instrument ręczny umieszczono w WL i delikatnie opiłowano ściany kanału. Z kanału korzeniowego pobrano wstępną próbkę mikrobiologiczną (S1) sterylnymi bibułkami umieszczanymi kolejno w WL. Do kanału korzeniowego wprowadzono trzy sterylne sączki papierowe w celu pobrania próbki. Każdy papierowy punkt pozostawiano w kanale na około 1 minutę. Zarówno sączki papierowe, jak i ręczny instrument endodontyczny, bez rękojeści, przeniesiono do krioprobówek zawierających 300 μl roztworu PBS, przechowywanych w temperaturze -20°C. Próbki zostały przekazane do laboratorium analiz genetycznych w celu dalszej analizy w łańcuchu chłodniczym.

Kanały korzeniowe opracowano przy użyciu pilników Revo S i obfitej irygacji 2,5% NaOCl. Kanały powiększono wierzchołkowo do rozmiaru 35 (AS35) na długości roboczej. Pomiędzy każdą zmianą instrumentu kanał korzeniowy płukano 5 ml 2,5% roztworu NaOCl. W sumie zużyto więc 30 ml roztworu do irygacji. Po zakończeniu instrumentacji warstwę mazistą usunięto za pomocą 17% EDTA, który pozostawiono w kanale na 3 minuty, a następnie 2,5% NaOCl. Kanał korzeniowy osuszono jałowymi sączkami papierowymi i przepłukano 2 ml 10% tiosiarczanu sodu przez 1 min w celu inaktywacji roztworu NaOCl. Następnie z kanałów pobrano próbkę (S2), jak opisano dla S1. Po opracowaniu kanał był leczony żelem Ca(OH)2 lub 2% chlorheksydyną w zależności od grupy badanej. W grupie CH proszek wodorotlenku wapnia (Calxyl; OCO Products, Dirnstein, Niemcy) zmieszano z solą fizjologiczną w stosunku 1:1 i pastę wprowadzono do kanału za pomocą spiral lentulo (Malleifer-Dentsply). W grupie CHX 2% żel chlorheksydyny (Gluco-Chex 2% żel, Cerkamed, Stalowa Wola, Polska) wprowadzano do kanałów korzeni tej grupy za pomocą Ultradent Capillary Tip (produkty Ultradent). Wszystkie kanały korzeniowe z 2 powyższych grup uszczelniono 1-milimetrowym wacikiem i co najmniej 3-milimetrową warstwą tymczasowego materiału wypełniającego (Cavit G; 3M ESPE AG, Seefeld, Niemcy).

Po 7 dniach ząb został odizolowany, usunięto uzupełnienie tymczasowe i przeprowadzono zabiegi dezynfekcji pola operacyjnego według tego samego protokołu co podczas pierwszej wizyty. Uzyskano nową próbkę kontrolną korony zęba i zębiny otaczającej komorę miazgi (SR2). Lek usunięto za pomocą 5 ml roztworu soli fizjologicznej i ostrożnie opiłowano kanał głównym pilnikiem wierzchołkowym. W przypadku grup stosujących Ca(OH)2 działanie przeciwdrobnoustrojowe wodorotlenku wapnia zneutralizowano 0,5% kwasem cytrynowym na okres 1 minuty, który następnie usunięto 5 ml roztworu soli. Tak więc dla grup z żelem CHX lek zobojętniono mieszaniną 0,3% L-α-lecytyny i 3% Tween 80 (Zamany A, Spangberg LS (2002) Skuteczna metoda inaktywacji chlorheksydyny. chirurgia jamy ustnej, medycyna jamy ustnej, patologia jamy ustnej, radiologia jamy ustnej i endodoncja). Następnie kanały korzeniowe przepłukano 2 ml roztworu soli fizjologicznej. Próbkę po podaniu leku (S3) uzyskano w taki sam sposób, jak pobrano próbkę przed podaniem leku i wysłano do analizy PCR.

Po końcowej procedurze pobierania próbek warstwę mazistą usunięto przez irygację 5 ml 17% EDTA, a następnie końcowe płukanie 10 ml wody destylowanej. Zakończenie leczenia kanałowego poprzedzone zostało wypełnieniem korzenia metodą kondensacji bocznej gutaperki. Ubytki dostępu uzupełniono żywicą kompozytową (Z250, 3M Corporation, Saint Paul, MN, USA) i wykonano końcowe zdjęcie rentgenowskie.

Całkowite obciążenie bakteryjne, a także ilość Enterococcus faecalis określono przed instrumentacją, po instrumentacji i zastosowaniu leków dokanałowych za pomocą ddPCR.

Izolacja genomowego DNA i pomiar stężenia DNA DNA ekstrahowano przy użyciu zestawu QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Niemcy) zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta. Przed izolacją DNA próbki (probówki z papierowymi sączkami) trawiono w temperaturze 50-60°C przez worteksowanie przez 30 sekund co 10 minut, aby zapewnić dezagregację wszystkich bakterii do roztworu PBS. Następnie z zawiesiny aseptycznie usunięto sączki papierowe i zawiesinę bakteryjną osadzono przez wirowanie przez 10 minut przy 5000 g. Następnie osad ponownie zawieszono w 180 ul buforu ATL dostarczonego przez QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Niemcy) i dodano 20 ul proteinazy K (20 mg/ml). Próbki inkubowano przez 3 godziny w temperaturze 56°C. Następnie wyizolowano całkowity bakteryjny genomowy DNA zgodnie z protokołem zestawu QIAamp DNA Mini Kit. Końcowa objętość roztworu DNA każdej próbki wynosiła 150 μl i została uwzględniona podczas obliczeń. Stężenie DNA (absorbancję przy 260 nm) określono za pomocą spektrofotometru (Promega Quantifluor).

Amplifikacja genów 16S rRNA W tym badaniu zaprojektowano startery dla genów Universal i Enterococcus 16S rRNA. Po ekstrakcji DNA z próbek za pomocą zestawu QIAamp DNA Mini Kit sekwencje 16S rRNA o długości 700–800 pz zamplifikowano przy użyciu uniwersalnego startera do przodu E8F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') i uniwersalnego startera do tyłu E1115R (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3') 59. Końcową objętość reakcji PCR dla każdego wyizolowanego szczepu bakteryjnego doprowadzono do 25 µl. Reakcje amplifikacji genów 16S rRNA przeprowadzono w następujących warunkach. 1 cykl wstępnej denaturacji w 95°C przez 3 minuty, 35 cykli w 95°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund i 72°C przez 30 sekund, które są kontynuowane z końcowym etapem wydłużania w 72°C przez 10 minut .

Produkty PCR analizowano metodą elektroforezy z użyciem 2% żelu agarozowego (zawierającego bromek etydyny) w buforze Tris/BoratE/EDTA (TBE), przy czym żele analizowano w świetle ultrafioletowym (przy 140 V przez 20 minut). Ich obrazy wizualizowano w świetle ultrafioletowym. Ponadto kontrolę i optymalizację starterów do ddPCR przeprowadzono również w konwencjonalnym PCR.

Oczyszczanie i sekwencjonowanie genu 16S rRNA Po reakcjach PCR oczyszczanie produktów PCR odbywa się poprzez hydrolizę nadmiaru starterów i nukleotydów za pomocą ExoSap-IT (Thermo, PN: 78201.1.ML) zawierającego enzymy egzonukleazy I i fosfatazy alkalicznej. 2 µl ExoSap-IT zmieszano z 5 µl produktu PCR dla każdej próbki. Reakcję ExoSap przeprowadza się w temperaturze 37°C przez 15 minut (aktywacja enzymu), a następnie przez 15 minut (inaktywacja) w temperaturze 80°C. Reakcje sekwencjonowania przeprowadzono stosując zestaw do cyklicznego sekwencjonowania Bigdye™ Terminator v3.1 (Thermo). Reakcje przeprowadzono zgodnie z instrukcją zestawu dla wszystkich wyizolowanych szczepów.

Po oczyszczeniu produktów za pomocą Exosap, reakcję sekwencyjną przeprowadzono za pomocą zestawu BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo) w następujących warunkach. Po sekwencji PCR produkty BigDye oczyszczono metodą okrężnicy. Do tego procesu użyto zestawu Zymo ZR DNA Sequencing Clean-up Kit (Zymo Research, USA). Wszystkie próbki oczyszczono zgodnie z protokołem podanym w zestawie i wykonano na analizatorze genetycznym 3130XL.

Droplet Digital PCR (ddPCR) Droplet Digital PCR (ddPCR) przeprowadzono stosując startery zaprojektowane zgodnie z regionem 16S rRNA specyficznym dla wszystkich bakterii i gatunków Enterococcus faecalis, po zsekwencjonowaniu, bezwzględnym oznaczeniu ilościowym gatunków bakterii znalezionych w próbce papierowej. Pary starterów to 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' i 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 dla wszystkich bakterii oraz ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCGAGT-3' i ENT-R-5'-GCCATGCGGCATAAACTG Pary starterów -3' dla Enterococcus Faecalis. W reakcji PCR amplikony zamplifikowane z nieoznakowanymi parami starterów analizowano przez znakowanie barwnikiem Eva-Green. W celu bezwzględnego oznaczenia ilościowego Enterococcus i całkowitego rRNA 16S przeprowadzono PCR z dwiema parami starterów z tej samej próbki. 20 µl mieszaniny PCR zawierającej 10 µl 2X ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad, nr kat. NIE. 1864034), 9 µl wody wolnej od nukleaz, 0,25 µl startera do przodu i do tyłu oraz 2 ng DNA z każdej próbki Warunki cykli termicznych były następujące: 95◦C przez 5 min, następnie 40 cykli w 95◦C przez 30 s i 60°C przez 1 min i dwa końcowe etapy w 4°C przez 5 minut i 90°C przez 5 minut z nieskończonym utrzymywaniem w 4°C. Po zakończeniu PCR szczelnie zamkniętą płytkę przeniesiono do uchwytu płytki czytnika kropli QX200 (Bio-Rad, nr kat. NIE. 1864003).