O efeito do Ca(OH)2 na periodontite apical

Critérios de elegibilidade A população do estudo consistiu em 16 pacientes (6 mulheres e 10 homens, com idades entre 19 e 63 anos, idade média de 34,43 anos) que se apresentaram na clínica endodôntica da Istanbul Medipol University Dental School, para retratamento endodôntico não cirúrgico de dentes com lesões de periodontite apical. Dezesseis dentes previamente tratados com canal radicular exibindo evidências clínicas e radiográficas de lesões de periodontite apical crônica foram incluídos neste estudo. Radiograficamente, o diâmetro da radioluscência periapical variou de 2 a 7 mm. Dentes com periodontite apical pós-tratamento tiveram tratamento endodôntico concluído há mais de 2 anos e requereram retratamento. Os terminais das obturações do canal radicular variaram de 0-4 mm aquém do ápice radiográfico, sem sobreobturação. Os dentes tinham restaurações coronárias intactas, sem exposição óbvia do material de preenchimento radicular à cavidade oral. Os dentes selecionados tinham estrutura de coroa suficiente para isolamento adequado com um dique de borracha e mostravam ausência de bolsas periodontais ou nível de inserção mais profundo que 4 mm. Também foram aplicados critérios de exclusão, como segue: dentes de pacientes que receberam antibióticos nos últimos 3 meses ou que apresentavam alguma doença geral, dentes que não puderam ser isolados adequadamente com dique de borracha, dentes com ausência de selamento coronário, dentes com bolsa periodontal profundidade >4 mm; e dentes com fratura de coroa/raiz. Apenas um dente foi incluído de cada paciente.

Procedimentos de tratamento do canal radicular e amostragem Barragem de borracha e uma técnica asséptica foram usados ​​durante todo o retratamento endodôntico. Após a remoção da placa e isolamento do dique de borracha, o campo operatório foi limpo com peróxido de hidrogênio a 3% e desinfetado com solução de NaOCl a 2,5%. Em seguida, todas as restaurações coronárias, pinos e defeitos cariados foram removidos e a preparação do acesso foi concluída quando a obturação do canal radicular foi devidamente exposta. Em seguida, o dente (incluindo a câmara pulpar), pinça e dique de borracha adjacente foram novamente desinfetados com NaOCl 2,5%, seguido de inativação com tiossulfato de sódio 10% para evitar interferência na amostragem bacteriológica. Amostras de controle de esterilidade (SR1) foram retiradas da superfície do dente com um cotonete estéril Omni Swab (Whatman FTA, Sigma-Aldrich) com uma cabeça ejetável. As pontas de papel foram transferidas para criotubos contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS) armazenada a -20°C. Em cada caso, um único canal radicular foi amostrado para limitar a avaliação microbiana a um único ambiente ecológico. Em dentes multirradiculares, a raiz com lesão periapical foi selecionada. Se houvesse lesões periapicais em todas as raízes, o canal mais largo era selecionado. Dois dos canais incluídos neste estudo eram de dentes unitários, 3 eram canais vestibulares em pré-molares superiores, 1 canal palatino em molar superior e 10 canais distais em molares inferiores.

Obturações radiculares antigas foram removidas usando brocas Gates-Glidden (Dentsply Maillefer, Ballaigues, Suíça) e limas endodônticas sem o uso de solventes químicos. O comprimento de trabalho (WL) foi estabelecido 1 mm abaixo do forame apical com um localizador de ápice (Raypex6; VDW GmbH, Munique, Alemanha) e, em seguida, foram feitas radiografias periapicais para garantir que todo o material obturador foi removido. A irrigação com solução salina estéril foi realizada para remover qualquer material remanescente e umedecer o canal antes da coleta da amostra. Em seguida, o canal foi preenchido com solução salina e um pequeno instrumento manual foi colocado no WL e usado para limar suavemente as paredes do canal. Uma amostra microbiológica inicial (S1) foi retirada do canal radicular com pontas de papel estéril colocadas consecutivamente no WL. Três pontas de papel estéril foram inseridas no canal radicular para amostragem. Cada ponta de papel foi deixada no canal por cerca de 1 minuto. Tanto as pontas de papel quanto o instrumento endodôntico manual, sem o cabo, foram transferidos para criotubos contendo 300 μL de solução PBS armazenados a -20°C. As amostras foram transferidas para o laboratório de análises genéticas para posterior análise na cadeia de frio.

Os canais radiculares foram preparados usando as limas Revo S e irrigação abundante com 2,5% de NaOCl. Os canais foram apicalmente alargados para o tamanho 35 (AS35) no comprimento de trabalho. Entre cada troca de instrumento, o canal radicular foi irrigado com 5 mL de solução de NaOCl a 2,5%. Assim, foi utilizado um total de 30 mL da solução irrigadora. Após a conclusão da instrumentação, a smear layer foi removida com 17% de EDTA, que foi deixado no canal por 3 minutos, seguido de 2,5% de NaOCl. O canal radicular foi seco com pontas de papel estéril e lavado com 2 mL de tiossulfato de sódio a 10% por 1 minuto para inativar a solução de NaOCl. Em seguida, uma amostra (S2) foi retirada dos canais conforme descrito para S1. Após o preparo, o canal foi medicado com Ca(OH)2 ou gel de clorexidina 2% com base no grupo de estudo. No grupo CH, pó de hidróxido de cálcio (Calxyl; OCO Products, Dirnstein, Alemanha) foi misturado com solução salina na proporção de 1:1 e a pasta foi inserida no canal usando espirais lentulo (Malleifer-Dentsply). No grupo CHX, gel de clorexidina 2% (Gluco-Chex 2% gel, Cerkamed, Stalowa Wola, Polland) foi colocado nos canais radiculares deste grupo com uma Ponta Capilar Ultradent (produtos Ultradent). Todos os canais radiculares dos 2 grupos acima foram selados com uma bolinha de algodão de 1 mm e uma camada de pelo menos 3 mm de material obturador temporário (Cavit G; 3M ESPE AG, Seefeld, Alemanha).

Após 7 dias, o dente foi isolado, a restauração temporária removida e os procedimentos de desinfecção do campo operatório foram realizados seguindo o mesmo protocolo usado na primeira visita. Uma nova amostra de controle da coroa dentária e dentina ao redor da câmara pulpar foi obtida (SR2). A medicação foi removida com 5 mL de solução salina e obturando cuidadosamente o canal com uma lima apical master. Para os grupos que usaram Ca(OH)2, a atividade antimicrobiana do hidróxido de cálcio foi neutralizada com ácido cítrico a 0,5% por um período de 1 minuto, que foi então removido com 5 mL de solução salina. Assim, para os grupos com gel de CHX, o medicamento foi neutralizado com uma mistura de 0,3% de L-α-lecitina e 3% de Tween 80 (Zamany A, Spangberg LS (2002) Um método eficaz de inativar a clorexidina. Cirurgia Oral, Medicina Oral, Patologia Oral, Radiologia Oral e Endodontia). Em seguida, os canais radiculares foram irrigados com 2 mL de solução salina. A amostra pós-medicamento (S3) foi obtida da mesma forma que a amostra pré-medicamento foi coletada e enviada para análise de PCR.

Após o procedimento de amostragem final, a smear layer foi removida por irrigação com 5 mL de EDTA a 17% e, em seguida, um enxágue final com 10 mL de água destilada. A conclusão do tratamento do canal radicular prosseguiu com a obturação usando condensação lateral de guta-percha. As cavidades de acesso foram restauradas com resina composta (Z250, 3M Corporation, Saint Paul, MN, EUA) e uma radiografia final foi feita.

As cargas bacterianas totais, bem como a quantidade de Enterococcus faecalis foram determinadas antes da instrumentação, após a instrumentação e uso das medicações intracanal, por meio de ddPCR.

Isolamento do DNA genômico e medição da concentração do DNA O DNA foi extraído usando o QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Germany) seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Antes do isolamento do DNA, as amostras (os tubos com pontas de papel) foram digeridas a 50-60°C POR vortex por 30s a cada 10 min, a fim de garantir a desagregação de todas as bactérias na solução de PBS. Em seguida, os cones de papel foram removidos assepticamente da suspensão e a suspensão bacteriana foi peletizada por centrifugação por 10 min a 5000 g. O sedimento foi então ressuspenso em 180 µl de tampão ATL fornecido pelo QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha) e foram adicionados 20 µl de proteinase K (20 mg/ml). As amostras foram incubadas por 3 h a 56°C. Posteriormente, o DNA genômico bacteriano total foi isolado de acordo com o protocolo do QIAamp DNA Mini Kit. O volume final da solução de DNA de cada amostra foi de 150 μL e foi levado em consideração durante o cálculo. A concentração de DNA (absorvância a 260 nm) foi determinada com um espectrofotômetro (Promega Quantifluor).

Amplificação dos genes 16S rRNA Primers para os genes Universal e Enterococcus 16S rRNA foram desenhados neste estudo. Após a extração de DNA de amostras com QIAamp DNA Mini Kit, 700-800 pb de sequências de 16S rRNA foram amplificadas usando o iniciador direto universal E8F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') e o iniciador reverso universal E1115R (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3') 59. O volume final das reações de PCR para cada cepa bacteriana isolada foi ajustado para 25 µl. As reações de amplificação dos genes 16S rRNA foram realizadas com as seguintes condições. 1 ciclo de pré-desnaturação a 95°C por 3 minutos, 35 ciclos de 95°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundos que continuam com uma etapa de extensão final a 72°C por 10 minutos .

Os produtos da PCR foram analisados ​​por eletroforese utilizando gel de agarose 2% (contendo brometo de etídio) em tampão Tris/BoratE/EDTA (TBE), sendo os géis analisados ​​sob luz ultravioleta (140V por 20 minutos). Suas imagens foram visualizadas sob iluminação ultravioleta. Além disso, o controle e otimização dos primers a serem utilizados para ddPCR também foi feito na PCR convencional.

Purificação e Sequenciamento do Gene 16S rRNA Após as reações de PCR, a purificação dos produtos de PCR é feita por hidrólise do excesso de primers e nucleotídeos com ExoSap-IT (Thermo, PN: 78201.1.ML) contendo as enzimas Exonuclease I e Fosfatase Alcalina. 2 µl de ExoSap-IT foram misturados com 5 µl de produto de PCR para cada amostra. A reação ExoSap é realizada a 37 °C por 15 minutos (ativação da enzima) seguidos de 15 minutos (inativação) a 80 °C. As reações de sequenciamento foram realizadas usando o kit de sequenciamento de ciclo Bigdye™ Terminator v3.1 (Thermo). As reações foram realizadas de acordo com o manual do kit para todas as cepas isoladas.

Após a purificação dos produtos com Exosap, a reação de sequência foi realizada com BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo) nas seguintes condições. Após a sequência de PCR, os produtos BigDye foram purificados pelo método do cólon. O kit Zymo ZR DNA Sequencing Clean-up (Zymo Research, EUA) foi usado para este processo. Todas as amostras foram purificadas de acordo com o protocolo fornecido no kit e executadas no analisador genético 3130XL.

Droplet Digital PCR (ddPCR) O Droplet Digital PCR (ddPCR) foi realizado utilizando primers desenhados de acordo com a região 16S rRNA específica para bactérias totais e espécies de Enterococcus faecalis, após sequenciamento, quantificação absoluta das espécies bacterianas encontradas na amostra de ponta de papel. Os pares de primers eram 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' e 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 para bactérias totais e ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCGAGT-3' e ENT-R-5'-GCCATGCGGCATAAACTG -3' pares de primers para Enterococcus Faecalis. Na reação de PCR, amplicons amplificados com pares de primers não marcados foram analisados ​​por marcação com corante Eva-Green. Para a quantificação absoluta de Enterococcus e 16S rRNA total, a PCR foi realizada com dois pares de primers da mesma amostra. 20 µL de mistura de PCR contendo 10 µL de 2X ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad, cat. não. 1864034), 9 µL de água livre de nuclease, 0,25 µL de primer direto e reverso e 2 ng de DNA de cada amostra. 60◦C por 1 min e duas etapas finais a 4◦C por 5 minutos e 90◦C por 5 minutos com uma manutenção infinita de 4◦C. Após a conclusão da PCR, a placa selada foi transferida para o suporte de placa do QX200 Droplet Reader (Bio-Rad, cat. não. 1864003).