L'effet de Ca(OH)2 dans la parodontite apicale

Critères d'éligibilité La population de l'étude était composée de 16 patients (6 femmes et 10 hommes, âgés de 19 à 63 ans, âge moyen 34,43 ans) se présentant à la clinique d'endodontie de l'école dentaire de l'Université Medipol d'Istanbul, pour un retraitement endodontique non chirurgical de dents présentant des lésions de parodontite apicale. Seize dents préalablement traitées par canal radiculaire présentant des signes cliniques et radiographiques de lésions de parodontite apicale chronique ont été incluses dans cette étude. Radiographiquement, le diamètre de la radioclarté périapicale variait de 2 à 7 mm. Les dents atteintes de parodontite apicale post-traitement avaient subi un traitement endodontique plus de 2 ans plus tôt et nécessitaient un retraitement. Les extrémités des obturations canalaires variaient de 0 à 4 mm avant l'apex radiographique, sans sur-remplissage. Les dents avaient des restaurations coronales intactes, sans exposition évidente du matériau d'obturation radiculaire à la cavité buccale. Les dents sélectionnées avaient une structure de couronne suffisante pour une isolation adéquate avec une digue en caoutchouc et présentaient une absence de poches parodontales ou de niveau d'attache plus profond que 4 mm. Des critères d'exclusion ont également été appliqués, comme suit : dents de patients ayant reçu des antibiotiques au cours des 3 derniers mois ou qui avaient une maladie générale, dents qui n'ont pas pu être correctement isolées avec une digue en caoutchouc, dents avec absence de scellement coronaire, dents avec poche parodontale profondeur > 4 mm ; et dents présentant une fracture couronne/racine. Une seule dent a été incluse pour chaque patient.

Procédures de traitement du canal radiculaire et échantillonnage Une digue en caoutchouc et une technique aseptique ont été utilisées tout au long du retraitement endodontique. Après élimination de la plaque et isolement de la digue en caoutchouc, le champ opératoire a été nettoyé avec du peroxyde d'hydrogène à 3 % et désinfecté avec une solution de NaOCl à 2,5 %. Ensuite, toutes les restaurations coronales, tenons et défauts carieux ont été retirés et la préparation de l'accès a été terminée lorsque l'obturation canalaire a été correctement exposée. Ensuite, la dent (y compris la chambre pulpaire), la pince et la digue en caoutchouc adjacente ont été à nouveau désinfectées avec du NaOCl à 2,5 %, suivies d'une inactivation avec du thiosulfate de sodium à 10 % afin d'éviter toute interférence avec l'échantillonnage bactériologique. Des échantillons de contrôle de stérilité (SR1) ont été prélevés à la surface de la dent avec un Omni Swab stérile (Whatman FTA, Sigma-Aldrich) avec une tête éjectable. Les pointes de papier ont été transférées dans des cryotubes contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stockée à -20°C. Dans chaque cas, un seul canal radiculaire a été prélevé afin de limiter l'évaluation microbienne à un seul environnement écologique. Dans les dents multiradiculées, la racine avec la lésion périapicale a été sélectionnée. S'il y avait des lésions périapicales dans toutes les racines, le canal le plus large a été sélectionné. Deux des canaux inclus dans cette étude provenaient de dents à racine unique, 3 étaient des canaux buccaux dans les prémolaires maxillaires, 1 canal palatin dans la molaire maxillaire et 10 canaux distaux dans les molaires mandibulaires.

Les anciennes obturations radiculaires ont été retirées à l'aide de forets Gates-Glidden (Dentsply Maillefer, Ballaigues, Suisse) et de limes endodontiques sans l'utilisation de solvants chimiques. La longueur de travail (WL) a été établie à 1 mm du foramen apical avec un localisateur d'apex (Raypex6; VDW GmbH, Munich, Allemagne), puis des radiographies périapicales ont été prises pour s'assurer que tout le matériau de remplissage a été retiré. L'irrigation avec une solution saline stérile a été effectuée afin d'éliminer tout matériau restant et d'humidifier le canal avant le prélèvement de l'échantillon. Ensuite, le canal a été laissé rempli de solution saline et un petit instrument à main a été placé au WL et utilisé pour limer doucement les parois du canal. Un échantillon microbiologique initial (S1) a été prélevé du canal radiculaire avec des pointes de papier stériles placées consécutivement au WL. Trois pointes de papier stériles ont été insérées dans le canal radiculaire pour le prélèvement. Chaque point de papier a été laissé dans le canal pendant environ 1 minute. Les pointes en papier et l'instrument à main endodontique, sans le manche, ont été transférés dans des cryotubes contenant 300 μL de solution PBS conservés à -20°C. Les échantillons ont été transférés au laboratoire d'analyse génétique pour une analyse plus approfondie dans la chaîne du froid.

Les canaux radiculaires ont été préparés en utilisant les limes Revo S et une irrigation abondante avec du NaOCl à 2,5 %. Les canaux ont été élargis apicalement à la taille 35 (AS35) à la longueur de travail. Entre chaque changement d'instrument, le canal radiculaire était irrigué avec 5 mL d'une solution de NaOCl à 2,5 %. Par conséquent, un total de 30 ml de la solution d'irrigation a été utilisé. Une fois l'instrumentation terminée, la boue dentinaire a été retirée avec 17 % d'EDTA, qui a été laissé dans le canal pendant 3 minutes, suivi de 2,5 % de NaOCl. Le canal radiculaire a été séché avec des pointes de papier stériles et rincé avec 2 mL de thiosulfate de sodium à 10 % pendant 1 min pour inactiver la solution de NaOCl. Ensuite, un échantillon (S2) a été prélevé dans les canaux comme décrit pour S1. Après préparation, le canal a été médicamenté avec du Ca(OH)2 ou du gel de chlorhexidine à 2 % en fonction du groupe d'étude. Dans le groupe CH, de la poudre d'hydroxyde de calcium (Calxyl ; OCO Products, Dirnstein, Allemagne) a été mélangée à une solution saline dans un rapport de 1 : 1 et la pâte a été insérée dans le canal à l'aide de spirales lentulo (Malleifer-Dentsply). Dans le groupe CHX, un gel de chlorhexidine à 2 % (gel Gluco-Chex à 2 %, Cerkamed, Stalowa Wola, Pologne) a été placé dans les canaux radiculaires de ce groupe avec une pointe capillaire Ultradent (produits Ultradent). Tous les canaux radiculaires des 2 groupes ci-dessus ont été scellés avec une boulette de coton de 1 mm et une couche d'au moins 3 mm de matériau d'obturation temporaire (Cavit G ; 3M ESPE AG, Seefeld, Allemagne).

Après 7 jours, la dent a été isolée, la restauration provisoire retirée et les procédures de désinfection du champ opératoire ont été effectuées selon le même protocole utilisé lors de la première visite. Un nouvel échantillon témoin de la couronne dentaire et de la dentine entourant la chambre pulpaire a été obtenu (SR2). Le médicament a été retiré avec 5 ml de solution saline et en limant soigneusement le canal avec une lime apicale maîtresse. Pour les groupes utilisant Ca(OH)2, l'activité antimicrobienne de l'hydroxyde de calcium a été neutralisée avec de l'acide citrique à 0,5 % pendant une période de 1 minute, qui a ensuite été éliminée avec 5 ml de solution saline. Ainsi, pour les groupes avec gel CHX, le médicament a été neutralisé avec un mélange de 0,3% de L-α-lécithine et 3% de Tween 80 (Zamany A, Spangberg LS (2002) An effective method of inactivating chlorhexidine. chirurgie buccale, médecine buccale, pathologie buccale, radiologie buccale et endodontie). Ensuite, les canaux radiculaires ont été irrigués avec 2 ml de solution saline. L'échantillon post-médicament (S3) a été obtenu de la même manière que l'échantillon pré-médicament a été collecté et envoyé pour l'analyse PCR.

Après la procédure d'échantillonnage finale, la boue dentinaire a été éliminée par irrigation avec 5 ml d'EDTA à 17 %, puis un rinçage final avec 10 ml d'eau distillée. La fin du traitement canalaire s'est poursuivie par une obturation radiculaire par condensation latérale de gutta-percha. Les cavités d'accès ont été restaurées avec de la résine composite (Z250, 3M Corporation, Saint Paul, MN, USA) et une radiographie finale a été prise.

Les charges bactériennes totales, ainsi que la quantité d'Enterococcus faecalis ont été déterminées avant l'instrumentation, après l'instrumentation et l'utilisation des médicaments intracanalaires, au moyen de ddPCR.

Isolement de l'ADN génomique et mesure de la concentration d'ADN L'ADN a été extrait à l'aide du kit QIAamp DNA Mini (Qiagen, Allemagne) en suivant le protocole recommandé par le fabricant. Avant l'isolement de l'ADN, les échantillons (les tubes avec des pointes de papier) ont été digérés à 50-60 ° C PAR vortex pendant 30 secondes toutes les 10 minutes afin d'assurer la désagrégation de toutes les bactéries dans la solution PBS. Ensuite, les pointes de papier ont été retirées aseptiquement de la suspension et la suspension bactérienne a été culottée par centrifugation pendant 10 min à 5000 g. Le culot a ensuite été remis en suspension dans 180 µl de tampon ATL fourni par QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Allemagne) et 20 µl de protéinase K (20 mg/ml) ont été ajoutés. Les échantillons ont été incubés pendant 3 heures à 56°C. Par la suite, l'ADN génomique bactérien total a été isolé selon le protocole du QIAamp DNA Mini Kit. Le volume final de solution d'ADN de chaque échantillon était de 150 μL et a été pris en compte lors du calcul. La concentration d'ADN (absorbance à 260 nm) a été déterminée avec un spectrophotomètre (Promega Quantifluor).

Amplification des gènes d'ARNr 16S Des amorces pour les gènes d'ARNr 16S Universal et Enterococcus ont été conçues dans cette étude. Après extraction de l'ADN des échantillons avec le kit QIAamp DNA Mini, 700-800 bp de séquences d'ARNr 16S ont été amplifiées en utilisant l'amorce directe universelle E8F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') et l'amorce inverse universelle E1115R (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3') 59. Le volume final des réactions PCR pour chaque souche bactérienne isolée a été ajusté à 25 µl. Les réactions d'amplification des gènes d'ARNr 16S ont été réalisées dans les conditions suivantes. 1 cycle de prédénaturation à 95°C pendant 3 minutes, 35 cycles de 95°C pendant 30 secondes, 55°C pendant 30 secondes et 72°C pendant 30 secondes qui se poursuivent par une étape finale d'extension à 72°C pendant 10 minutes .

Les produits de PCR ont été analysés par électrophorèse en utilisant un gel d'agarose à 2 % (contenant du bromure d'éthidium) dans un tampon Tris/BoratE/EDTA (TBE), les gels étant analysés sous lumière ultraviolette (à 140 V pendant 20 minutes). Leurs images ont été visualisées sous éclairage ultraviolet. De plus, le contrôle et l'optimisation des amorces à utiliser pour la ddPCR ont également été effectués en PCR conventionnelle.

Purification et séquençage du gène ARNr 16S Après les réactions de PCR, la purification des produits de PCR se fait en hydrolysant les amorces et les nucléotides en excès avec ExoSap-IT (Thermo, PN : 78201.1.ML) contenant les enzymes Exonucléase I et Alkaline Phosphatase. 2 µl d'ExoSap-IT ont été mélangés avec 5 µl de produit PCR pour chaque échantillon. La réaction ExoSap est effectuée à 37 °C pendant 15 minutes (activation enzymatique) suivies de 15 minutes (inactivation) à 80 °C. Les réactions de séquençage ont été réalisées à l'aide du kit de séquençage de cycle Bigdye™ Terminator v3.1 (Thermo). Les réactions ont été réalisées selon le manuel du kit pour toutes les souches isolées.

Après purification des produits avec Exosap, la réaction de séquence a été réalisée avec BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo) dans les conditions suivantes. Après la séquence PCR, les produits BigDye ont été purifiés par la méthode du côlon. Le kit de nettoyage de séquençage d'ADN Zymo ZR (Zymo Research, USA) a été utilisé pour ce processus. Tous les échantillons ont été purifiés conformément au protocole donné dans le kit et exécutés sur l'analyseur génétique 3130XL.

PCR numérique en gouttelettes (ddPCR) La PCR numérique en gouttelettes (ddPCR) a été réalisée à l'aide d'amorces conçues selon la région d'ARNr 16S spécifique aux bactéries totales et aux espèces d'Enterococcus faecalis, après séquençage, quantification absolue à partir des espèces bactériennes trouvées dans l'échantillon de pointe de papier. Les paires d'amorces étaient 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' et 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 pour les bactéries totales et ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCCTCCCGAGT-3' et ENT-R-5'-GCCATGCGGCATAAACTG -3' paires d'amorces pour Enterococcus Faecalis. Dans la réaction PCR, les amplicons amplifiés avec des paires d'amorces non marquées ont été analysés par marquage avec le colorant Eva-Green. Pour la quantification absolue d'Enterococcus et de l'ARNr 16S total, la PCR a été réalisée avec deux paires d'amorces du même échantillon. 20 µL de mélange PCR contenant 10 µL de 2X ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad, cat. Non. 1864034), 9 µL d'eau sans nucléase, 0,25 µL d'amorce sens et antisens et 2 ng d'ADN de chaque échantillon Les conditions de cycle thermique étaient : 95◦C pendant 5 min, puis 40 cycles de 95◦C pendant 30 s et 60◦C pendant 1 min et deux étapes finales à 4◦C pendant 5 minutes et 90◦C pendant 5 minutes avec un maintien infini à 4◦C. Une fois la PCR terminée, la plaque scellée a été transférée dans le porte-plaque du QX200 Droplet Reader (Bio-Rad, cat. Non. 1864003).