Effekten av Ca(OH)2 i apikal periodontitt

Kvalifikasjonskriterier Studiepopulasjonen besto av 16 pasienter (6 kvinner og 10 menn, i alderen 19-63 år, gjennomsnittsalder 34,43) som oppsøkte den endodontiske klinikken ved Istanbul Medipol University Dental School for ikke-kirurgisk endodontisk gjenbehandling av tenner med apikale periodontittlesjoner. Seksten tidligere rotkanalbehandlede tenner som viser kliniske og radiografiske tegn på kroniske apikale periodontittlesjoner ble inkludert i denne studien. Radiografisk varierte diameteren til den periapikale radiolucensen fra 2 til 7 mm. Tenner med apikal periodontitt etter behandling hadde endodontisk behandling fullført mer enn 2 år tidligere og krevde ny behandling. Termini av rotkanalfyllingene varierte fra 0-4 mm fra den radiografiske apex, uten overfylling. Tennene hadde intakte koronale restaureringer, uten åpenbar eksponering av rotfyllingsmaterialet til munnhulen. Utvalgte tenner hadde nok kronestruktur for tilstrekkelig isolasjon med en gummidemning og viste fravær av periodontale lommer eller festenivå dypere enn 4 mm. Eksklusjonskriterier ble også brukt, som følger: tenner fra pasienter som hadde fått antibiotika i løpet av de siste 3 månedene eller som hadde noen generell sykdom, tenner som ikke kunne isoleres ordentlig med gummidemning, tenner uten koronar forsegling, tenner med periodontallomme dybde >4 mm; og tenner med krone/rotbrudd. Kun én tann ble inkludert fra hver pasient.

Rotkanalbehandlingsprosedyrer og prøvetaking Gummidemning og en aseptisk teknikk ble brukt gjennom hele den endodontiske gjenbehandlingen. Etter plakkfjerning og kofferdamisolering ble operasjonsfeltet renset med 3 % hydrogenperoksid og desinfisert med 2,5 % NaOCl-løsning. Deretter ble alle koronale restaureringer, stolper og kariesdefekter fjernet og adkomstforberedelse ble fullført når rotfyllingen var ordentlig eksponert. Deretter ble tannen (inkludert pulpakammeret), klemmen og tilstøtende gummidemning igjen desinfisert med 2,5 % NaOCl, etterfulgt av inaktivering med 10 % natriumtiosulfat for å unngå interferens med bakteriologisk prøvetaking. Sterilitetskontrollprøver (SR1) ble tatt fra tannoverflaten med en steril Omni Swab (Whatman FTA, Sigma-Aldrich) med et utkastbart hode. Papirpunkter ble overført til kryorør inneholdende fosfatbufret saltvannsoppløsning (PBS) lagret ved -20°C. I hvert tilfelle ble det tatt prøver av en enkelt rotkanal for å begrense den mikrobielle evalueringen til et enkelt økologisk miljø. Ved flerrotede tenner ble roten med den periapikale lesjonen valgt. Hvis det var periapikale lesjoner i alle røttene, ble den bredere kanalen valgt. To av kanalene som ble inkludert i denne studien var fra enrotede tenner, 3 var bukkalkanaler i maxillære premolarer, 1 palatalkanal i maxillære molarer og 10 distale kanaler i mandibulære molarer.

Gamle rotfyllinger ble fjernet ved hjelp av Gates-Glidden-bor (Dentsply Maillefer, Ballaigues, Sveits) og endodontiske filer uten bruk av kjemiske løsemidler. Arbeidslengden (WL) ble etablert 1 mm kort fra det apikale foramen med en apex locator (Raypex6; VDW GmbH, München, Tyskland) og deretter ble det tatt periapikale røntgenbilder for å sikre at alt fyllmateriale ble fjernet. Irrigasjon med steril saltløsning ble utført for å fjerne gjenværende materialer og for å fukte kanalen før prøvetaking. Deretter ble kanalen fylt med saltvann, og et lite håndinstrument ble plassert ved WL og brukt til å file kanalveggene forsiktig. En første mikrobiologisk prøve (S1) ble tatt fra rotkanalen med sterile papirpunkter fortløpende plassert ved WL. Tre sterile papirpunkter ble satt inn i rotkanalen for prøvetaking. Hvert papirpunkt ble liggende i kanalen i ca. 1 minutt. Både papirpunktene og det endodontiske håndinstrumentet, uten håndtaket, ble overført til kryorør som inneholdt 300 μL PBS-løsning lagret ved -20 °C. Prøvene ble overført til genetisk analyselaboratorium for videre analyse i kjølekjede.

Rotkanaler ble forberedt ved å bruke Revo S-filene og rikelig vanning med 2,5 % NaOCl. Kanalene ble apikalt forstørret til størrelse 35 (AS35) ved arbeidslengden. Mellom hvert instrumentbytte ble rotkanalen irrigert med 5 ml 2,5 % NaOCl-løsning. Derfor ble totalt 30 ml av vanningsløsningen brukt. Etter at instrumenteringen var fullført, ble smørelaget fjernet med 17 % EDTA, som ble liggende i kanalen i 3 minutter, etterfulgt av 2,5 % NaOCl. Rotkanalen ble tørket med sterile papirpunkter og spylt med 2 ml 10 % natriumtiosulfat i 1 min for å inaktivere NaOCl-løsningen. Deretter ble en prøve (S2) tatt fra kanalene som beskrevet for S1. Etter klargjøring ble kanalen medisinert med enten Ca(OH)2 eller 2% klorheksidingel basert på studiegruppen. I CH-gruppen ble kalsiumhydroksidpulver (Calxyl; OCO Products, Dirnstein, Tyskland) blandet med saltvann i forholdet 1:1 og pastaen ble satt inn i kanalen ved bruk av lentulospiraler (Malleifer-Dentsply). I CHX-gruppen ble klorheksidingel 2 % (Gluco-Chex 2 % gel, Cerkamed, Stalowa Wola, Polen) plassert i rotkanalene til denne gruppen med en Ultradent kapillærtupp (Ultradent-produkter). Alle rotkanalene i de 2 gruppene ovenfor ble forseglet med en 1 mm bomullspellet og minst 3 mm lag med midlertidig fyllmateriale (Cavit G; 3M ESPE AG, Seefeld, Tyskland).

Etter 7 dager ble tannen isolert, den midlertidige restaureringen fjernet, og desinfeksjonsprosedyrer for operasjonsfeltet ble utført etter samme protokoll som ble brukt i det første besøket. En ny kontrollprøve av tannkronen og dentinet rundt pulpakammeret ble oppnådd (SR2). Medisinen ble fjernet med 5 mL saltvannsoppløsning og ved forsiktig å fylle kanalen med en master apikal fil. For gruppene som brukte Ca(OH)2 ble den antimikrobielle aktiviteten av kalsiumhydroksid nøytralisert med 0,5 % sitronsyre i en periode på 1 minutt, som deretter ble fjernet med 5 ml saltvannsløsning. For gruppene med CHX-gel ble således medikamentet nøytralisert med en blanding av 0,3 % L-α-lecitin og 3 % Tween 80 (Zamany A, Spangberg LS (2002) En effektiv metode for inaktivering av klorheksidin. Oral kirurgi, oral medisin, oral patologi, oral radiologi og endodonti). Deretter ble rotkanalene vannet med 2 ml saltvannsløsning. Prøven etter medikament (S3) ble oppnådd på samme måte som prøven før medikament ble samlet og sendt til PCR-analyse.

Etter den siste prøvetakingsprosedyren ble smørelaget fjernet ved skylling med 5 ml 17 % EDTA og deretter en siste skylling med 10 ml destillert vann. Gjennomføring av rotbehandlingen fortsatte med rotfylling ved hjelp av lateral kondensering av guttaperka. Tilgangshulrom ble restaurert med komposittharpiks (Z250, 3M Corporation, Saint Paul, MN, USA), og et siste røntgenbilde ble tatt.

Total bakteriebelastning, samt mengden av Enterococcus faecalis ble bestemt før instrumentering, etter instrumentering og bruk av de intrakanale medikamentene, ved hjelp av ddPCR.

Genomisk DNA-isolering og måling av DNA-konsentrasjon DNA ble ekstrahert ved bruk av QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Tyskland) etter protokollen anbefalt av produsenten. Før DNA-isolering ble prøver (rørene med papirspisser) fordøyd ved 50-60 °C VED vortexing i 30 sekunder hvert 10. minutt for å sikre oppløsning av alle bakterier i PBS-løsningen. Etterpå ble papirpunktene aseptisk fjernet fra suspensjonen, og bakteriesuspensjonen ble pelletert ved sentrifugering i 10 minutter ved 5000 g. Pelleten ble deretter resuspendert i 180 µl buffer ATL levert av QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Tyskland) og 20 µl proteinase K (20 mg/ml) ble tilsatt. Prøver ble inkubert i 3 timer ved 56°C. Deretter ble total bakteriell genomisk DNA isolert i henhold til protokollen til QIAamp DNA Mini Kit. Det endelige volumet av DNA-løsning for hver prøve var 150 μL og ble tatt i betraktning under beregningen. DNA-konsentrasjon (absorbans ved 260 nm) ble bestemt med et spektrofotometer (Promega Quantifluor).

Amplifisering av 16S rRNA gener Primere for Universal og Enterococcus 16S rRNA gener ble designet i denne studien. Etter DNA-ekstraksjon av prøver med QIAamp DNA Mini Kit, ble 700-800 bp av 16S rRNA-sekvenser amplifisert ved å bruke universal E8F forward primer (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') og universal E1115R revers primer (5'-AGGGGTTG3'CTTT) 59. Det endelige volumet av PCR-reaksjoner for hver isolert bakteriestamme ble justert til 25 ul. Amplifikasjonsreaksjonene til 16S rRNA-gener ble utført med følgende betingelser. 1 syklus med predenaturering ved 95 °C i 3 minutter, 35 sykluser med 95 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder og 72 °C i 30 sekunder som fortsetter med et siste forlengelsestrinn ved 72 °C i 10 minutter .

PCR-produktene ble analysert ved elektroforese ved bruk av 2 % agarosegel (inneholdende etidiumbromid) i Tris/BoratE/EDTA (TBE) buffer, med geler som ble analysert under ultrafiolett lys (ved 140V i 20 minutter). Bildene deres ble visualisert under ultrafiolett belysning. I tillegg ble kontrollen og optimaliseringen av primere som skal brukes for ddPCR også gjort i konvensjonell PCR.

Rensing og sekvensering av 16S rRNA-genet Etter PCR-reaksjonene gjøres rensingen av PCR-produkter ved å hydrolysere overskuddet av primere og nukleotider med ExoSap-IT (Thermo, PN: 78201.1.ML) som inneholder eksonuklease I og alkaliske fosfatase-enzymer. 2 µl ExoSap-IT ble blandet med 5 µl PCR-produkt for hver prøve. ExoSap-reaksjonen utføres ved 37 °C i 15 minutter (enzymaktivering) etterfulgt av 15 minutter (inaktivering) ved 80 °C. Sekvensreaksjoner ble utført ved å bruke Bigdye™ Terminator v3.1 syklussekvenseringssett (Thermo). Reaksjonene ble utført i henhold til kitmanualen for alle isolerte stammer.

Etter rensing av produktene med Exosap ble sekvensreaksjonen utført med BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo) under følgende forhold. Etter sekvens-PCR ble BigDye-produktene renset ved kolonmetoden. Zymo ZR DNA Sequencing Clean-up Kit (Zymo Research, USA) ble brukt til denne prosessen. Alle prøver ble renset i henhold til protokollen gitt i settet og utført på 3130XL genetisk analysator.

Droplet Digital PCR (ddPCR) Droplet Digital PCR (ddPCR) ble utført ved bruk av primere designet i henhold til 16S rRNA-regionen som er spesifikk for de totale bakteriene og Enterococcus faecalis-arter, etter sekvensering, absolutt kvantifisering fra bakterieartene funnet i papirpunktprøven. Primerpar var 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' og 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 for totale bakterier og ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCGAGT-3' og ENT-R-5'-GCCACATGCGGCATA -3' primerpar for Enterococcus Faecalis. I PCR-reaksjonen ble amplikoner amplifisert med umerkede primerpar analysert ved merking med Eva-Green-fargestoff. For absolutt kvantifisering av Enterococcus og totalt 16S rRNA ble PCR utført med to primerpar fra samme prøve. 20 µL PCR-blanding som inneholder 10 µL 2X ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad, kat. Nei. 1864034), 9 µL nukleasefritt vann, 0,25 µL av både forover- og reversprimer og 2 ng DNA fra hver prøve Termiske syklusforhold var: 95◦C i 5 minutter, deretter 40 sykluser med 95◦C i 30 s og 60◦C i 1 min og to siste trinn ved 4◦C i 5 minutter og 90◦C i 5 minutter med 4◦C uendelig hold. Etter at PCR var fullført, ble den forseglede platen overført til plateholderen til QX200 Droplet Reader (Bio-Rad, kat. Nei. 1864003).