Virkningen af ​​Ca(OH)2 i apikal parodontitis

Berettigelseskriterier Undersøgelsespopulationen bestod af 16 patienter (6 kvinder og 10 mænd, i alderen 19-63 år, gennemsnitsalder 34,43), der præsenterede endodontisk klinik på Istanbul Medipol University Dental School for ikke-kirurgisk endodontisk genbehandling af tænder med apikale parodontitis læsioner. Seksten tidligere rodkanalbehandlede tænder, der udviser kliniske og radiografiske tegn på kroniske apikale parodontitis læsioner, blev inkluderet i denne undersøgelse. Radiografisk varierede diameteren af ​​den periapikale radiolucens fra 2 til 7 mm. Tænder med apikal parodontitis efter behandling havde endodontisk behandling afsluttet mere end 2 år tidligere og krævede genbehandling. Enderne af rodkanalfyldningerne varierede fra 0-4 mm fra den radiografiske apex, uden overfyldning. Tænderne havde intakte koronale restaureringer, uden nogen tydelig eksponering af det rodfyldende materiale til mundhulen. Udvalgte tænder havde nok kronestruktur til tilstrækkelig isolering med en gummidæmning og viste fravær af periodontale lommer eller fastgørelsesniveau dybere end 4 mm. Udelukkelseskriterier blev også anvendt som følger: tænder fra patienter, der havde modtaget antibiotika inden for de foregående 3 måneder, eller som havde en generel sygdom, tænder, der ikke kunne isoleres ordentligt med gummidæmning, tænder uden koronar tætning, tænder med periodontal lomme dybde >4 mm; og tænder med krone/rodbrud. Der blev kun inkluderet en tand fra hver patient.

Rodbehandlingsprocedurer og prøveudtagning Gummidæmning og en aseptisk teknik blev brugt under hele den endodontiske genbehandling. Efter plakfjernelse og gummidæmningsisolering blev operationsfeltet renset med 3% hydrogenperoxid og desinficeret med 2,5% NaOCl-opløsning. Derefter blev alle koronale restaureringer, stolper og kariesdefekter fjernet, og adgangsforberedelse blev afsluttet, når rodkanalfyldningen var ordentligt frilagt. Bagefter blev tanden (inklusive pulpakammeret), klemmen og den tilstødende gummidæmning igen desinficeret med 2,5 % NaOCl, efterfulgt af inaktivering med 10 % natriumthiosulfat for at undgå interferens med bakteriologisk prøveudtagning. Sterilitetskontrolprøver (SR1) blev taget fra tandoverfladen med en steril Omni Swab (Whatman FTA, Sigma-Aldrich) med et udkastbart hoved. Papirpunkter blev overført til kryorør indeholdende phosphatpufret saltvandsopløsning (PBS) opbevaret ved -20°C. I hvert tilfælde blev der udtaget en enkelt rodkanal for at begrænse den mikrobielle evaluering til et enkelt økologisk miljø. I multirodede tænder blev roden med den periapikale læsion udvalgt. Hvis der var periapikale læsioner i alle rødder, blev den bredere kanal valgt. To af kanalerne inkluderet i denne undersøgelse var fra enkeltrodede tænder, 3 var bukkale kanaler i maksillære præmolarer, 1 palatalkanal i maxillære molarer og 10 distale kanaler i mandibular kindtænder.

Gamle rodfyldninger blev fjernet ved hjælp af Gates-Glidden bor (Dentsply Maillefer, Ballaigues, Schweiz) og endodontiske filer uden brug af kemiske opløsningsmidler. Arbejdslængden (WL) blev etableret 1 mm kort fra det apikale foramen med en apex-locator (Raypex6; VDW GmbH, München, Tyskland), og derefter blev der taget periapikale røntgenbilleder for at sikre, at alt fyldmateriale blev fjernet. Irrigation med steril saltvandsopløsning blev udført for at fjerne eventuelle resterende materialer og for at fugte kanalen før prøvetagning. Dernæst blev kanalen efterladt fyldt med saltvand, og et lille håndinstrument blev placeret ved WL og brugt til forsigtigt at file kanalvæggene. En indledende mikrobiologisk prøve (S1) blev taget fra rodkanalen med sterile papirpunkter anbragt fortløbende ved WL. Tre sterile papirpunkter blev indsat i rodkanalen til prøveudtagning. Hvert papirpunkt blev efterladt i kanalen i ca. 1 minut. Både papirspidserne og det endodontiske håndinstrument uden håndtaget blev overført til kryorør indeholdende 300 μL PBS-opløsning opbevaret ved -20°C. Prøverne blev overført til genetisk analyselaboratorium for yderligere analyse i kølekæde.

Rodkanaler blev forberedt ved at bruge Revo S filerne og rigelig vanding med 2,5% NaOCl. Kanalerne blev apikalt forstørret til størrelse 35 (AS35) i arbejdslængden. Mellem hvert instrumentskift blev rodkanalen skyllet med 5 ml 2,5 % NaOCl-opløsning. Derfor blev der brugt i alt 30 ml af skylleopløsningen. Efter at instrumenteringen var afsluttet, blev udstrygningslaget fjernet med 17 % EDTA, som blev efterladt i kanalen i 3 minutter, efterfulgt af 2,5 % NaOCl. Rodkanalen blev tørret med sterile papirspidser og skyllet med 2 ml 10% natriumthiosulfat i 1 minut for at inaktivere NaOCl-opløsningen. Derefter blev der taget en prøve (S2) fra kanalerne som beskrevet for S1. Efter klargøring blev kanalen medicineret med enten Ca(OH)2 eller 2% klorhexidingel baseret på undersøgelsesgruppen. I CH-gruppen blev calciumhydroxidpulver (Calxyl; OCO Products, Dirnstein, Tyskland) blandet med saltvand i forholdet 1:1, og pastaen blev indsat i kanalen ved hjælp af lentulospiraler (Malleifer-Dentsply). I CHX-gruppen blev klorhexidingel 2% (Gluco-Chex 2% gel, Cerkamed, Stalowa Wola, Polen) anbragt i rodkanalerne i denne gruppe med en Ultradent-kapillærspids (Ultradent-produkter). Alle rodkanaler i de 2 ovennævnte grupper blev forseglet med en 1 mm bomuldspellet og mindst 3 mm lag af midlertidigt fyldmateriale (Cavit G; 3M ESPE AG, Seefeld, Tyskland).

Efter 7 dage blev tanden isoleret, den midlertidige restaurering fjernet, og desinfektionsprocedurer af operationsområdet blev udført efter den samme protokol, som blev brugt ved det første besøg. En ny kontrolprøve af tandkronen og dentinet, der omgiver pulpakammeret, blev opnået (SR2). Medicinen blev fjernet med 5 ml saltvandsopløsning og ved omhyggeligt at fylde kanalen med en master apikal fil. For grupperne, der anvender Ca(OH)2, blev den antimikrobielle aktivitet af calciumhydroxid neutraliseret med 0,5 % citronsyre i en periode på 1 minut, som derefter blev fjernet med 5 ml saltvandsopløsning. For grupperne med CHX-gel blev medikamentet således neutraliseret med en blanding af 0,3% L-a-lecithin og 3% Tween 80 (Zamany A, Spangberg LS (2002) En effektiv metode til inaktivering af chlorhexidin. Oral kirurgi, oral medicin, oral patologi, oral radiologi og endodonti). Derefter blev rodkanalerne skyllet med 2 ml saltvandsopløsning. Postlægemiddelprøven (S3) blev opnået på samme måde som præmedikamentprøven blev opsamlet og sendt til PCR-analyse.

Efter den sidste prøveudtagningsprocedure blev udstrygningslaget fjernet ved skylning med 5 mL17% EDTA og derefter en sidste skylning med 10 mL destilleret vand. Afslutning af rodbehandlingen fortsatte med rodfyldning ved hjælp af lateral kondensering af guttaperka. Adgangshulrum blev genoprettet med kompositharpiks (Z250, 3M Corporation, Saint Paul, MN, USA), og der blev taget et endeligt røntgenbillede.

Den samlede bakteriemængde samt mængden af ​​Enterococcus faecalis blev bestemt før instrumentering, efter instrumentering og brug af de intracanale medikamenter ved hjælp af ddPCR.

Genomisk DNA-isolering og måling af DNA-koncentration DNA blev ekstraheret ved hjælp af QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Tyskland) efter den protokol, der anbefales af producenten. Før DNA-isolering blev prøver (rørene med papirspidser) fordøjet ved 50-60 °C VED hvirveldannelse i 30 sekunder i hvert 10. minut for at sikre disaggregering af alle bakterier i PBS-opløsningen. Bagefter blev papirspidserne fjernet aseptisk fra suspensionen, og bakteriesuspensionen blev pelleteret ved centrifugering i 10 minutter ved 5000 g. Pelleten blev derefter resuspenderet i 180 µl buffer ATL leveret af QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Tyskland), og 20 µl proteinase K (20 mg/ml) blev tilsat. Prøver blev inkuberet i 3 timer ved 56°C. Efterfølgende blev total bakteriel genomisk DNA isoleret i henhold til protokollen for QIAamp DNA Mini Kit. Det endelige volumen af ​​DNA-opløsning af hver prøve var 150 μL og blev taget i betragtning under beregningen. DNA-koncentration (absorbans ved 260 nm) blev bestemt med et spektrofotometer (Promega Quantifluor).

Amplifikation af 16S rRNA gener Primere for Universal og Enterococcus 16S rRNA gener blev designet i denne undersøgelse. Efter DNA-ekstraktion af prøver med QIAamp DNA Mini Kit blev 700-800 bp af 16S rRNA-sekvenser amplificeret ved at bruge universel E8F fremad primer (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') og universel E1115R revers primer (5'-AGGGGTTG3'CT) 59. Det endelige volumen af ​​PCR-reaktioner for hver isoleret bakteriestamme blev justeret til 25 µl. Amplifikationsreaktionerne af 16S rRNA-gener blev udført med følgende betingelser. 1 cyklus med prædenaturering ved 95°C i 3 minutter, 35 cykler af 95°C i 30 sekunder, 55°C i 30 sekunder og 72°C i 30 sekunder, som fortsætter med et sidste forlængelsestrin ved 72°C i 10 minutter .

PCR-produkterne blev analyseret ved elektroforese under anvendelse af 2% agarosegel (indeholdende ethidiumbromid) i Tris/BoratE/EDTA (TBE) buffer, hvor geler blev analyseret under ultraviolet lys (ved 140V i 20 minutter). Deres billeder blev visualiseret under ultraviolet belysning. Derudover blev kontrollen og optimeringen af ​​primere til brug for ddPCR også udført i konventionel PCR.

Oprensning og sekventering af 16S rRNA-genet Efter PCR-reaktionerne udføres oprensningen af ​​PCR-produkter ved at hydrolysere de overskydende primere og nukleotider med ExoSap-IT (Thermo, PN: 78201.1.ML) indeholdende Exonuclease I og Alkaline Phosphatase enzymer. 2 µl ExoSap-IT blev blandet med 5 µl PCR-produkt for hver prøve. ExoSap-reaktionen udføres ved 37 °C i 15 minutter (enzymaktivering) efterfulgt af 15 minutter (inaktivering) ved 80 °C. Sekvenseringsreaktioner blev udført ved at bruge Bigdye™ Terminator v3.1 cyklussekventeringskit (Thermo). Reaktionerne blev udført i henhold til kitmanualen for alle isolerede stammer.

Efter oprensning af produkterne med Exosap blev sekvensreaktionen udført med BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo) under følgende betingelser. Efter sekvens-PCR blev BigDye-produkter oprenset ved kolonmetoden. Zymo ZR DNA Sequencing Clean-up Kit (Zymo Research, USA) blev brugt til denne proces. Alle prøver blev oprenset i overensstemmelse med protokollen givet i sættet og udført på 3130XL genetisk analysator.

Droplet Digital PCR (ddPCR) Droplet Digital PCR (ddPCR) blev udført ved hjælp af primere designet i henhold til 16S rRNA-regionen, der er specifik for de totale bakterier og Enterococcus faecalis-arter, efter sekventering, absolut kvantificering fra bakteriearterne fundet i papirpunktprøven. Primerpar var 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' og 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 for totale bakterier og ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCGAGT-3' og ENT-R-5'-GCCACATGCGGCATA -3' primerpar for Enterococcus Faecalis. I PCR-reaktionen blev amplikoner amplificeret med umærkede primerpar analyseret ved mærkning med Eva-Green farvestof. Til absolut kvantificering af Enterococcus og totalt 16S rRNA blev PCR udført med to primerpar fra den samme prøve. 20 µL PCR-blanding indeholdende 10 µL 2X ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad, kat. ingen. 1864034), 9 µL nukleasefrit vand, 0,25 µL af både fremadgående og reverse primer og 2 ng DNA fra hver prøve Termiske cyklusforhold var: 95 ◦C i 5 minutter, derefter 40 cyklusser af 95◦C i 30 s. 60◦C i 1 min og to sidste trin ved 4◦C i 5 minutter og 90◦C i 5 minutter med 4◦C uendeligt hold. Efter at PCR var afsluttet, blev den forseglede plade overført til pladeholderen på QX200 Droplet Reader (Bio-Rad, kat. ingen. 1864003).