Účinek Ca(OH)2 u apikální parodontitidy

Kritéria způsobilosti Populaci studie tvořilo 16 pacientů (6 žen a 10 mužů, ve věku 19-63 let, průměrný věk 34,43), kteří se dostavili na endodontickou kliniku na Istanbul Medipol University Dental School za účelem nechirurgického endodontického přeléčení zubů s apikálními lézemi periodontitidy. Do této studie bylo zahrnuto šestnáct zubů dříve ošetřených kořenovým kanálkem vykazujících klinický a radiografický důkaz chronických apikálních parodontitidových lézí. Radiograficky se průměr periapikální radiolucence pohyboval od 2 do 7 mm. Zuby s apikální parodontitidou po léčbě měly endodontickou terapii dokončenou před více než 2 roky a vyžadovaly přeléčení. Konce výplní kořenového kanálku byly v rozmezí 0-4 mm od radiografického apexu, bez přeplnění. Zuby měly intaktní koronální výplně, bez zjevné expozice materiálu pro výplň kořene do ústní dutiny. Vybrané zuby měly dostatečnou strukturu korunky pro adekvátní izolaci kofferdamem a nevykazovaly absenci parodontálních kapes nebo úroveň připojení hlouběji než 4 mm. Dále byla uplatněna vylučovací kritéria, a to takto: zuby pacientů, kteří dostávali antibiotika během předchozích 3 měsíců nebo kteří měli nějaké celkové onemocnění, zuby, které nebylo možné správně izolovat kofferdamem, zuby bez koronárního těsnění, zuby s periodontální kapsou hloubka >4 mm; a zuby se zlomeninou korunky/kořenu. Od každého pacienta byl zahrnut pouze jeden zub.

Postupy ošetření kořenového kanálku a odběr vzorků Během endodontického ošetření byly použity kofferdam a aseptická technika. Po odstranění plaku a izolaci kofferdamu bylo operační pole vyčištěno 3% peroxidem vodíku a dezinfikováno 2,5% roztokem NaOCl. Poté byly odstraněny všechny koronální výplně, čepy a kariézní defekty a byla dokončena příprava přístupu, když byla výplň kořenového kanálku řádně obnažena. Poté byl zub (včetně dřeňové komůrky), svorka a přilehlý kofferdam ještě jednou dezinfikován 2,5% NaOCl s následnou inaktivací 10% thiosíranem sodným, aby se zabránilo interferenci s bakteriologickým odběrem vzorků. Vzorky pro kontrolu sterility (SR1) byly odebrány z povrchu zubu sterilním tamponem Omni Swab (Whatman FTA, Sigma-Aldrich) s vysouvací hlavou. Papírové body byly přeneseny do kryozkumavek obsahujících fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) skladovaný při -20 °C. V každém případě byl odebrán vzorek z jednoho kořenového kanálku, aby se mikrobiální hodnocení omezilo na jediné ekologické prostředí. U vícekořenových zubů byl vybrán kořen s periapikální lézí. Pokud byly periapikální léze ve všech kořenech, byl vybrán širší kanál. Dva kanály zahrnuté v této studii byly z jednokořenových zubů, 3 byly bukální kanálky v maxilárních premolárech, 1 palatinový kanál v maxilárním moláru a 10 distálních kanálků v dolních molárech.

Staré kořenové výplně byly odstraněny pomocí vrtáků Gates-Glidden (Dentsply Maillefer, Ballaigues, Švýcarsko) a endodontických pilníků bez použití chemických rozpouštědel. Pracovní délka (WL) byla stanovena o 1 mm kratší od apikálního foramenu pomocí apexlokátoru (Raypex6; VDW GmbH, Mnichov, Německo) a poté byly pořízeny periapikální rentgenové snímky, aby se zajistilo odstranění veškerého výplňového materiálu. Před odběrem vzorku bylo provedeno oplachování sterilním fyziologickým roztokem, aby se odstranily všechny zbývající materiály a zvlhčil kanál. Dále byl kanál naplněn fyziologickým roztokem a malý ruční nástroj byl umístěn na WL a použit k jemnému pilování stěn kanálu. Počáteční mikrobiologický vzorek (S1) byl odebrán z kořenového kanálku pomocí sterilních papírových hrotů umístěných postupně na WL. Pro odběr vzorků byly do kořenového kanálku vloženy tři sterilní papírové hroty. Každý papírový bod byl ponechán v kanálu asi 1 minutu. Jak papírové hroty, tak endodontický nástroj na ruku, bez rukojeti, byly přeneseny do kryozkumavek obsahujících 300 μl roztoku PBS skladovaného při -20 °C. Vzorky byly přeneseny do laboratoře genetické analýzy k další analýze v chladovém řetězci.

Kořenové kanálky byly připraveny použitím souborů Revo S a vydatným zavlažováním 2,5% NaOCl. Kanálky byly apikálně zvětšeny na velikost 35 (AS35) v pracovní délce. Mezi každou výměnou nástroje byl kořenový kanálek ​​propláchnut 5 ml 2,5% roztoku NaOCl. Bylo tedy použito celkem 30 ml irigačního roztoku. Po dokončení instrumentace byla vrstva stěru odstraněna pomocí 17% EDTA, která byla ponechána v kanálku po dobu 3 minut, a následně 2,5% NaOCl. Kořenový kanálek ​​byl vysušen pomocí sterilních papírových hrotů a proplachován 2 ml 10% thiosíranu sodného po dobu 1 minuty, aby se inaktivoval roztok NaOCl. Dále byl odebrán vzorek (S2) z kanálků, jak je popsáno pro S1. Po přípravě byl kanálek ​​medikován buď Ca(OH)2 nebo 2% chlorhexidinovým gelem podle studijní skupiny. Ve skupině CH byl prášek hydroxidu vápenatého (Calxyl; OCO Products, Dirnstein, Německo) smíchán s fyziologickým roztokem v poměru 1:1 a pasta byla vložena do kanálku pomocí spirálek lentulo (Malleifer-Dentsply). Ve skupině CHX byl chlorhexidinový gel 2% (Gluco-Chex 2% gel, Cerkamed, Stalowa Wola, Polsko) umístěn do kořenových kanálků této skupiny pomocí Ultradent Capillary Tip (produkty Ultradent). Všechny kořenové kanálky 2 výše uvedených skupin byly utěsněny 1 mm bavlněnou peletou a alespoň 3 mm vrstvou dočasného výplňového materiálu (Cavit G; 3M ESPE AG, Seefeld, Německo).

Po 7 dnech byl zub izolován, provizorní náhrada odstraněna a byly provedeny dezinfekční procedury operačního pole podle stejného protokolu jako při první návštěvě. Byl získán nový kontrolní vzorek zubní korunky a dentinu obklopujícího dřeňovou komůrku (SR2). Lék byl odstraněn pomocí 5 ml fyziologického roztoku a pečlivým vyplněním kanálu hlavním apikálním pilníkem. U skupin používajících Ca(OH)2 byla antimikrobiální aktivita hydroxidu vápenatého neutralizována 0,5% kyselinou citrónovou po dobu 1 minuty, která byla poté odstraněna 5 ml fyziologického roztoku. Pro skupiny s CHX gelem bylo tedy léčivo neutralizováno směsí 0,3 % L-a-lecitinu a 3 % Tween 80 (Zamany A, Spangberg LS (2002) Účinná metoda inaktivace chlorhexidinu. Orální chirurgie, orální medicína, orální patologie, orální radiologie a endodoncie). Dále byly kořenové kanálky propláchnuty 2 ml fyziologického roztoku. Vzorek po podání léku (S3) byl získán stejným způsobem, jako byl odebrán vzorek před podáním léku a odeslán na analýzu PCR.

Po konečném odběru vzorků byla vrstva stěru odstraněna propláchnutím 5 ml 17% EDTA a poté konečným opláchnutím 10 ml destilované vody. Dokončení ošetření kořenového kanálku probíhalo kořenovou výplní pomocí laterální kondenzace gutaperči. Přístupové dutiny byly obnoveny kompozitní pryskyřicí (Z250, 3M Corporation, Saint Paul, MN, USA) a byl pořízen konečný rentgenový snímek.

Celková bakteriální zátěž a také množství Enterococcus faecalis byly stanoveny před instrumentací, po instrumentaci a použití intrakanálních léčiv pomocí ddPCR.

Izolace genomové DNA a měření koncentrace DNA DNA byla extrahována pomocí sady QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Německo) podle protokolu doporučeného výrobcem. Před izolací DNA byly vzorky (zkumavky s papírovými hroty) štěpeny při teplotě 50-60 °C Vortexováním po dobu 30 s každých 10 minut, aby se zajistila disagregace všech bakterií do roztoku PBS. Poté byly papírové hroty asepticky odstraněny ze suspenze a bakteriální suspenze byla peletována centrifugací po dobu 10 minut při 5000 g. Peleta byla poté resuspendována ve 180 ul pufru ATL dodaného QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Německo) a bylo přidáno 20 ul proteinázy K (20 mg/ml). Vzorky byly inkubovány po dobu 3 hodin při 56 °C. Následně byla izolována celková bakteriální genomová DNA podle protokolu QIAamp DNA Mini Kit. Konečný objem roztoku DNA každého vzorku byl 150 μl a byl zohledněn při výpočtu. Koncentrace DNA (absorbance při 260 nm) byla stanovena spektrofotometrem (Promega Quantifluor).

Amplifikace genů 16S rRNA V této studii byly navrženy primery pro geny Universal a Enterococcus 16S rRNA. Po extrakci DNA vzorků pomocí sady QIAamp DNA Mini Kit bylo 700-800 bp sekvencí 16S rRNA amplifikováno pomocí univerzálního dopředného primeru E8F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') a univerzálního reverzního primeru E1115R (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3') 59. Konečný objem PCR reakcí pro každý izolovaný bakteriální kmen byl upraven na 25 ul. Amplifikační reakce 16S rRNA genů byly provedeny za následujících podmínek. 1 cyklus předdenaturace při 95 °C po dobu 3 minut, 35 cyklů při 95 °C po dobu 30 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 30 sekund, které pokračují konečným krokem prodloužení při 72 °C po dobu 10 minut .

Produkty PCR byly analyzovány elektroforézou za použití 2% agarózového gelu (obsahujícího ethidium bromid) v pufru Tris/BoratE/EDTA (TBE), přičemž gely byly analyzovány pod ultrafialovým světlem (při 140 V po dobu 20 minut). Jejich obrazy byly vizualizovány pod ultrafialovým osvětlením. Kromě toho kontrola a optimalizace primerů, které mají být použity pro ddPCR, byla také provedena v konvenční PCR.

Purifikace a sekvenování 16S rRNA genu Po PCR reakcích se purifikace PCR produktů provádí hydrolýzou přebytečných primerů a nukleotidů pomocí ExoSap-IT (Thermo, PN: 78201.1.ML) obsahujícího enzymy exonukleázu I a alkalickou fosfatázu. 2 ul ExoSap-IT byly smíchány s 5 ul produktu PCR pro každý vzorek. Reakce ExoSap se provádí při 37 °C po dobu 15 minut (aktivace enzymu) a následně 15 minut (inaktivace) při 80 °C. Sekvenační reakce byly provedeny s použitím cyklického sekvenačního kitu Bigdye™ Terminator v3.1 (Thermo). Reakce byly provedeny podle manuálu kitu pro všechny izolované kmeny.

Po čištění produktů pomocí Exosap byla sekvenční reakce provedena pomocí BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo) za následujících podmínek. Po sekvenční PCR byly produkty BigDye purifikovány metodou tlustého střeva. Pro tento proces byl použit Zymo ZR DNA Sequencing Clean-up Kit (Zymo Research, USA). Všechny vzorky byly purifikovány v souladu s protokolem uvedeným v soupravě a provedeny na genetickém analyzátoru 3130XL.

Droplet Digital PCR (ddPCR) Droplet Digital PCR (ddPCR) byla provedena pomocí primerů navržených podle oblasti 16S rRNA specifické pro všechny bakterie a druhy Enterococcus faecalis, po sekvenování, absolutní kvantifikaci z bakteriálních druhů nalezených ve vzorku papírového bodu. Páry primerů byly 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' a 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 pro celkové bakterie a ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCGAGT-3' a ENT-R-5'-CATGCCACTGCG -3' páry primerů pro Enterococcus Faecalis. V PCR reakci byly amplikony amplifikované neoznačenými páry primerů analyzovány značením barvivem Eva-Green. Pro absolutní kvantifikaci Enterococcus a celkové 16S rRNA byla provedena PCR se dvěma páry primerů ze stejného vzorku. 20 ul PCR směsi obsahující 10 ul 2X ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad, kat. Ne. 1864034), 9 µl vody bez nukleázy, 0,25 µl přímého i reverzního primeru a 2 ng DNA z každého vzorku Podmínky tepelného cyklování byly: 95 °C po dobu 5 minut, poté 40 cyklů při 95 °C po dobu 30 s a 60◦C po dobu 1 minuty a dva poslední kroky při 4◦C po dobu 5 minut a 90◦C po dobu 5 minut s nekonečnou výdrží 4◦C. Po dokončení PCR byla uzavřená destička přenesena do držáku destiček čtečky kapek QX200 (Bio-Rad, kat. Ne. 1864003).