L'effetto di Ca(OH)2 nella parodontite apicale

Criteri di ammissibilità La popolazione dello studio era composta da 16 pazienti (6 donne e 10 uomini, di età compresa tra 19 e 63 anni, età media 34,43) che si presentavano alla clinica endodontica presso la Istanbul Medipol University Dental School, per il ritrattamento endodontico non chirurgico di denti con lesioni parodontali apicali. In questo studio sono stati inclusi sedici denti precedentemente trattati con canale radicolare che mostravano evidenza clinica e radiografica di lesioni parodontite apicale cronica. Radiograficamente, il diametro della radiotrasparenza periapicale variava da 2 a 7 mm. I denti con parodontite apicale post-trattamento avevano la terapia endodontica completata più di 2 anni prima e richiedevano un ritrattamento. I termini delle otturazioni del canale radicolare variavano da 0 a 4 mm prima dell'apice radiografico, senza riempimento eccessivo. I denti presentavano restauri coronali intatti, senza evidente esposizione del materiale di otturazione radicolare alla cavità orale. I denti selezionati avevano una struttura della corona sufficiente per un adeguato isolamento con una diga di gomma e mostravano un'assenza di tasche parodontali o livello di attacco più profondo di 4 mm. Sono stati applicati anche i criteri di esclusione, come segue: denti di pazienti che avevano ricevuto antibiotici nei 3 mesi precedenti o che presentavano una malattia generale, denti che non potevano essere adeguatamente isolati con la diga di gomma, denti con assenza di sigillatura coronarica, denti con tasca parodontale profondità >4mm; e denti con frattura della corona/radice. Per ogni paziente è stato incluso un solo dente.

Procedure di trattamento del canale radicolare e campionamento La diga di gomma e una tecnica asettica sono state utilizzate durante il ritrattamento endodontico. Dopo la rimozione della placca e l'isolamento della diga di gomma, il campo operatorio è stato pulito con perossido di idrogeno al 3% e disinfettato con una soluzione di NaOCl al 2,5%. Quindi, tutti i restauri coronali, perni e difetti cariosi sono stati rimossi e la preparazione dell'accesso è stata completata quando l'otturazione del canale radicolare è stata correttamente esposta. Successivamente, il dente (compresa la camera pulpare), il morsetto e la diga di gomma adiacente sono stati nuovamente disinfettati con NaOCl al 2,5%, seguita da inattivazione con tiosolfato di sodio al 10% per evitare interferenze con il campionamento batteriologico. I campioni di controllo di sterilità (SR1) sono stati prelevati dalla superficie del dente con un Omni Swab sterile (Whatman FTA, Sigma-Aldrich) con una testa eiettabile. I punti di carta sono stati trasferiti in criotubi contenenti una soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) conservata a -20°C. In ogni caso, è stato campionato un singolo canale radicolare per limitare la valutazione microbica a un singolo ambiente ecologico. Nei denti con più radici è stata selezionata la radice con la lesione periapicale. Se erano presenti lesioni periapicali in tutte le radici, veniva selezionato il canale più largo. Due dei canali inclusi in questo studio provenivano da denti a radice singola, 3 erano canali buccali nei premolari mascellari, 1 canale palatale nel molare mascellare e 10 canali distali nei molari mandibolari.

Le vecchie otturazioni radicolari sono state rimosse utilizzando frese Gates-Glidden (Dentsply Maillefer, Ballaigues, Svizzera) e lime endodontiche senza l'uso di solventi chimici. La lunghezza di lavoro (WL) è stata stabilita 1 mm prima del forame apicale con un localizzatore apicale (Raypex6; VDW GmbH, Monaco, Germania) e quindi sono state eseguite radiografie periapicali per garantire che tutto il materiale di riempimento fosse rimosso. L'irrigazione con soluzione fisiologica sterile è stata eseguita per rimuovere eventuali residui di materiale e per inumidire il canale prima della raccolta del campione. Successivamente, il canale è stato lasciato riempito di soluzione fisiologica e un piccolo strumento manuale è stato posizionato nel WL e utilizzato per limare delicatamente le pareti del canale. Un campione microbiologico iniziale (S1) è stato prelevato dal canale radicolare con punti di carta sterili posizionati consecutivamente al WL. Tre punti di carta sterili sono stati inseriti nel canale radicolare per il campionamento. Ogni punto di carta è stato lasciato nel canale per circa 1 minuto. Sia le punte di carta che lo strumento endodontico della mano, senza il manico, sono stati trasferiti in criotubi contenenti 300 μL di soluzione PBS conservata a -20°C. I campioni sono stati trasferiti al laboratorio di analisi genetiche per ulteriori analisi nella catena del freddo.

I canali radicolari sono stati preparati utilizzando le lime Revo S e un'abbondante irrigazione con NaOCl al 2,5%. I canali sono stati allargati apicalmente alla misura 35 (AS35) alla lunghezza di lavoro. Tra ogni cambio di strumento, il canale radicolare è stato irrigato con 5 mL di soluzione di NaOCl al 2,5%. Pertanto, è stato utilizzato un totale di 30 mL della soluzione di irrigazione. Dopo che la strumentazione è stata completata, lo smear layer è stato rimosso con EDTA al 17%, che è stato lasciato nel canale per 3 minuti, seguito da NaOCl al 2,5%. Il canale radicolare è stato asciugato con punte di carta sterili e lavato con 2 mL di tiosolfato di sodio al 10% per 1 minuto per inattivare la soluzione di NaOCl. Successivamente, è stato prelevato un campione (S2) dai canali come descritto per S1. Dopo la preparazione, il canale è stato medicato con Ca(OH)2 o gel di clorexidina al 2% in base al gruppo di studio. Nel gruppo CH, la polvere di idrossido di calcio (Calxyl; OCO Products, Dirnstein, Germany) è stata miscelata con soluzione salina in rapporto 1:1 e la pasta è stata inserita nel canale utilizzando spirali di lentulo (Malleifer-Dentsply). Nel gruppo CHX, il gel di clorexidina 2% (Gluco-Chex 2% gel, Cerkamed, Stalowa Wola, Polland) è stato inserito nei canali radicolari di questo gruppo con una punta capillare Ultradent (prodotti Ultradent). Tutti i canali radicolari dei 2 gruppi di cui sopra sono stati sigillati con un pellet di cotone da 1 mm e uno strato di almeno 3 mm di materiale di riempimento provvisorio (Cavit G; 3M ESPE AG, Seefeld, Germania).

Dopo 7 giorni è stato isolato il dente, rimosso il provvisorio e sono state eseguite le procedure di disinfezione del campo operatorio seguendo lo stesso protocollo utilizzato nella prima visita. È stato ottenuto un nuovo campione di controllo della corona dentale e della dentina che circonda la camera pulpare (SR2). Il farmaco è stato rimosso con 5 mL di soluzione fisiologica e limando accuratamente il canale con una lima apicale master. Per i gruppi che utilizzavano Ca(OH)2, l'attività antimicrobica dell'idrossido di calcio è stata neutralizzata con acido citrico allo 0,5% per un periodo di 1 minuto, che è stato poi rimosso con 5 mL di soluzione salina. Pertanto, per i gruppi con gel CHX, il medicamento è stato neutralizzato con una miscela di 0,3% di L-α-lecitina e 3% di Tween 80 (Zamany A, Spangberg LS (2002) Un metodo efficace per inattivare la clorexidina. Chirurgia Orale, Medicina Orale, Patologia Orale, Radiologia Orale ed Endodonzia). Successivamente, i canali radicolari sono stati irrigati con 2 mL di soluzione fisiologica. Il campione post medicamento (S3) è stato ottenuto nello stesso modo in cui il campione pre-farmaco è stato raccolto e inviato per l'analisi PCR.

Dopo la procedura di campionamento finale, lo smear layer è stato rimosso mediante irrigazione con 5 mL di EDTA al 17% e quindi un risciacquo finale con 10 mL di acqua distillata. Il completamento del trattamento del canale radicolare è proseguito con l'otturazione radicolare mediante condensazione laterale della guttaperca. Le cavità di accesso sono state restaurate con resina composita (Z250, 3M Corporation, Saint Paul, MN, USA) ed è stata eseguita una radiografia finale.

La carica batterica totale e la quantità di Enterococcus faecalis sono state determinate prima della strumentazione, dopo la strumentazione e l'uso dei medicamenti intracanali, mediante ddPCR.

Isolamento del DNA genomico e misurazione della concentrazione del DNA Il DNA è stato estratto utilizzando il kit QIAamp DNA Mini (Qiagen, Germania) seguendo il protocollo raccomandato dal produttore. Prima dell'isolamento del DNA, i campioni (le provette con punti di carta) sono stati digeriti a 50-60°C vortexando per 30 secondi ogni 10 minuti per garantire la disaggregazione di tutti i batteri nella soluzione PBS. Successivamente, le punte di carta sono state rimosse asetticamente dalla sospensione e la sospensione batterica è stata pellettizzata mediante centrifugazione per 10 minuti a 5000 g. Il pellet è stato quindi risospeso in 180 µl di tampone ATL fornito da QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germania) e sono stati aggiunti 20 µl di proteinasi K (20 mg/ml). I campioni sono stati incubati per 3 ore a 56°C. Successivamente, il DNA genomico batterico totale è stato isolato secondo il protocollo del kit QIAamp DNA Mini. Il volume finale della soluzione di DNA di ciascun campione era di 150 μL ed è stato preso in considerazione durante il calcolo. La concentrazione del DNA (assorbanza a 260 nm) è stata determinata con uno spettrofotometro (Promega Quantifluor).

Amplificazione dei geni 16S rRNA In questo studio sono stati progettati i primer per i geni 16S rRNA Universal ed Enterococcus. Dopo l'estrazione del DNA dei campioni con il kit QIAamp DNA Mini, 700-800 bp di sequenze di rRNA 16S sono state amplificate utilizzando il primer forward E8F universale (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') e il primer reverse E1115R universale (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3') 59. Il volume finale delle reazioni PCR per ciascun ceppo batterico isolato è stato regolato a 25 µl. Le reazioni di amplificazione dei geni 16S rRNA sono state eseguite con le seguenti condizioni. 1 ciclo di predenaturazione a 95°C per 3 minuti, 35 cicli di 95°C per 30 secondi, 55°C per 30 secondi e 72°C per 30 secondi che proseguono con una fase finale di estensione a 72°C per 10 minuti .

I prodotti della PCR sono stati analizzati mediante elettroforesi utilizzando gel di agarosio al 2% (contenente bromuro di etidio) in tampone Tris/BoratE/EDTA (TBE), con i gel analizzati sotto luce ultravioletta (a 140 V per 20 minuti). Le loro immagini sono state visualizzate sotto illuminazione ultravioletta. Inoltre, il controllo e l'ottimizzazione dei primer da utilizzare per ddPCR è stato effettuato anche nella PCR convenzionale.

Purificazione e sequenziamento del gene 16S rRNA Dopo le reazioni di PCR, la purificazione dei prodotti di PCR viene eseguita idrolizzando i primer ei nucleotidi in eccesso con ExoSap-IT (Thermo, PN: 78201.1.ML) contenente gli enzimi esonucleasi I e fosfatasi alcalina. 2 µl di ExoSap-IT sono stati miscelati con 5 µl di prodotto PCR per ciascun campione. La reazione ExoSap viene eseguita a 37 °C per 15 minuti (attivazione dell'enzima) seguiti da 15 minuti (inattivazione) a 80 °C. Le reazioni di sequenziamento sono state eseguite utilizzando il kit di sequenziamento del ciclo Bigdye™ Terminator v3.1 (Thermo). Le reazioni sono state eseguite secondo il manuale del kit per tutti i ceppi isolati.

Dopo la purificazione dei prodotti con Exosap, la reazione di sequenza è stata eseguita con BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo) nelle seguenti condizioni. Dopo la sequenza PCR, i prodotti BigDye sono stati purificati con il metodo del colon. Per questo processo è stato utilizzato il kit di pulizia del sequenziamento del DNA Zymo ZR (Zymo Research, USA). Tutti i campioni sono stati purificati secondo il protocollo fornito nel kit ed eseguiti sull'analizzatore genetico 3130XL.

Droplet Digital PCR (ddPCR) La Droplet Digital PCR (ddPCR) è stata eseguita utilizzando primer progettati secondo la regione rRNA 16S specifica per i batteri totali e le specie di Enterococcus faecalis, dopo il sequenziamento, la quantificazione assoluta dalle specie batteriche trovate nel campione di carta. Le coppie di primer erano 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' e 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 per i batteri totali e ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCGAGT-3' e ENT-R-5'-GCCATGCGGCATAAACTG -3' coppie di primer per Enterococcus Faecalis. Nella reazione PCR, gli ampliconi amplificati con coppie di primer non marcati sono stati analizzati mediante etichettatura con colorante Eva-Green. Per la quantificazione assoluta di Enterococcus e del 16S rRNA totale, la PCR è stata eseguita con due coppie di primer dello stesso campione. 20 µL di PCR mix contenente 10 µL di 2X ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad, cat. NO. 1864034), 9 µL di acqua priva di nucleasi, 0,25 µL di forward primer e reverse primer e 2 ng di DNA da ciascun campione Le condizioni del ciclo termico erano: 95◦C per 5 min, quindi 40 cicli di 95◦C per 30 s e 60◦C per 1 minuto e due passaggi finali a 4◦C per 5 minuti e 90◦C per 5 minuti con una tenuta infinita a 4◦C. Dopo che la PCR è stata completata, la piastra sigillata è stata trasferita nel portapiastre del QX200 Droplet Reader (Bio-Rad, cat. NO. 1864003).