Het effect van Ca(OH)2 bij apicale parodontitis

Toelatingscriteria De onderzoekspopulatie bestond uit 16 patiënten (6 vrouwen en 10 mannen, leeftijd 19-63 jaar, gemiddelde leeftijd 34,43 jaar) die zich presenteerden bij de endodontische kliniek van de Istanbul Medipol University Dental School, voor niet-chirurgische endodontische herbehandeling van tanden met apicale parodontitis laesies. Zestien eerder met een wortelkanaalbehandeling behandelde tanden die klinisch en radiografisch bewijs vertoonden van chronische apicale parodontitislaesies, werden in deze studie opgenomen. Radiografisch varieerde de diameter van de periapicale radiolucentie van 2 tot 7 mm. Tanden met apicale parodontitis na de behandeling hadden meer dan 2 jaar eerder endodontische therapie ondergaan en moesten opnieuw worden behandeld. Termini van de wortelkanaalvullingen varieerden van 0-4 mm onder de radiografische apex, zonder overvulling. De tanden hadden intacte coronale restauraties, zonder duidelijke blootstelling van het wortelvullende materiaal aan de mondholte. Geselecteerde tanden hadden voldoende kroonstructuur voor adequate isolatie met een rubberdam en vertoonden de afwezigheid van parodontale pockets of aanhechtingsniveau dieper dan 4 mm. Uitsluitingscriteria werden ook als volgt toegepast: tanden van patiënten die in de afgelopen 3 maanden antibiotica hadden gekregen of die een algemene ziekte hadden, tanden die niet goed konden worden geïsoleerd met rubberdam, tanden zonder coronaire afsluiting, tanden met parodontale pocket diepte >4 mm; en tanden met kroon/wortelbreuk. Van elke patiënt werd slechts één tand opgenomen.

Wortelkanaalbehandelingsprocedures en bemonstering Rubberdam en een aseptische techniek werden gebruikt tijdens de endodontische herbehandeling. Na verwijdering van tandplak en rubberdamisolatie werd het operatieveld gereinigd met 3% waterstofperoxide en gedesinfecteerd met 2,5% NaOCl-oplossing. Vervolgens werden alle coronale restauraties, stiften en carieuze defecten verwijderd en was de voorbereiding van de toegang voltooid toen de wortelkanaalvulling goed zichtbaar was. Daarna werden de tand (inclusief de pulpakamer), de klem en de aangrenzende rubberdam opnieuw gedesinfecteerd met 2,5% NaOCl, gevolgd door inactivatie met 10% natriumthiosulfaat om interferentie met bacteriologische bemonstering te voorkomen. Steriliteitscontrolemonsters (SR1) werden van het tandoppervlak genomen met een steriele Omni Swab (Whatman FTA, Sigma-Aldrich) met een uitwerpbare kop. Papierpunten werden overgebracht naar cryobuisjes die fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bevatten, opgeslagen bij -20°C. In elk geval werd een enkel wortelkanaal bemonsterd om de microbiële evaluatie te beperken tot een enkele ecologische omgeving. Bij tanden met meerdere wortels werd de wortel met de periapicale laesie geselecteerd. Als er periapicale laesies waren in alle wortels, werd het bredere kanaal gekozen. Twee van de kanalen die in dit onderzoek zijn opgenomen, waren van tanden met één wortel, 3 waren buccale kanalen in maxillaire premolaren, 1 palataal kanaal in maxillaire molaren en 10 distale kanalen in mandibulaire molaren.

Oude wortelvullingen werden verwijderd met behulp van Gates-Glidden-boren (Dentsply Maillefer, Ballaigues, Zwitserland) en endodontische vijlen zonder het gebruik van chemische oplosmiddelen. De werklengte (WL) werd vastgesteld op 1 mm van het apicale foramen met een apex locator (Raypex6; VDW GmbH, München, Duitsland) en vervolgens werden periapicale röntgenfoto's gemaakt om er zeker van te zijn dat al het vulmateriaal was verwijderd. Irrigatie met een steriele zoutoplossing werd uitgevoerd om eventueel achtergebleven materiaal te verwijderen en het kanaal te bevochtigen voorafgaand aan de monsterafname. Vervolgens werd het kanaal gevuld met zoutoplossing en werd een klein handinstrument bij de WL geplaatst en gebruikt om de kanaalwanden voorzichtig te vijlen. Een eerste microbiologisch monster (S1) werd uit het wortelkanaal genomen met achtereenvolgens steriele papierpunten op de WL. Drie steriele papierpunten werden in het wortelkanaal ingebracht voor bemonstering. Elke papierpunt bleef ongeveer 1 minuut in het kanaal. Zowel de paperpoints als het endodontische handinstrument, zonder het handvat, werden overgebracht naar cryobuisjes met 300 μl PBS-oplossing, bewaard bij -20°C. De monsters werden overgebracht naar het laboratorium voor genetische analyse voor verdere analyse in de koelketen.

Wortelkanalen werden voorbereid met behulp van de Revo S-vijlen en overvloedige irrigatie met 2,5% NaOCl. De kanalen werden apicaal vergroot tot maat 35 (AS35) op de werklengte. Tussen elke instrumentwisseling werd het wortelkanaal geïrrigeerd met 5 ml 2,5% NaOCl-oplossing. Daarom werd in totaal 30 ml van de irrigatieoplossing gebruikt. Nadat de instrumentatie was voltooid, werd de uitstrijklaag verwijderd met 17% EDTA, dat 3 minuten in het kanaal werd gelaten, gevolgd door 2,5% NaOCl. Het wortelkanaal werd gedroogd met steriele papierpunten en gedurende 1 minuut gespoeld met 2 ml 10% natriumthiosulfaat om de NaOCl-oplossing te inactiveren. Vervolgens werd een monster (S2) uit de kanalen genomen zoals beschreven voor S1. Na preparatie werd het kanaal gemedicineerd met de Ca(OH)2- of 2% chloorhexidinegel op basis van de onderzoeksgroep. In de CH-groep werd calciumhydroxidepoeder (Calxyl; OCO Products, Dirnstein, Duitsland) gemengd met zoutoplossing in een verhouding van 1:1 en de pasta werd in het kanaal ingebracht met behulp van lentulo-spiralen (Malleifer-Dentsply). In de CHX-groep werd chloorhexidinegel 2% (Gluco-Chex 2% gel, Cerkamed, Stalowa Wola, Polen) in de wortelkanalen van deze groep geplaatst met een Ultradent Capillary Tip (Ultradent-producten). Alle wortelkanalen van de 2 bovengenoemde groepen werden afgedicht met een wattenbolletje van 1 mm en een laag tijdelijk vulmateriaal van minimaal 3 mm (Cavit G; 3M ESPE AG, Seefeld, Duitsland).

Na 7 dagen werd de tand geïsoleerd, de tijdelijke restauratie verwijderd en werden desinfectieprocedures van het operatieveld uitgevoerd volgens hetzelfde protocol als bij het eerste bezoek. Een nieuw controlemonster van de tandkroon en het dentine rondom de pulpakamer werd verkregen (SR2). De medicatie werd verwijderd met 5 ml zoutoplossing en door het kanaal voorzichtig te vijlen met een master apicale vijl. Voor de groepen die Ca(OH)2 gebruikten, werd de antimicrobiële activiteit van calciumhydroxide gedurende 1 minuut geneutraliseerd met 0,5% citroenzuur, dat vervolgens werd verwijderd met 5 ml zoutoplossing. Dus voor de groepen met CHX-gel werd het medicijn geneutraliseerd met een mengsel van 0,3% L-α-lecithine en 3% Tween 80 (Zamany A, Spangberg LS (2002) Een effectieve methode om chloorhexidine te inactiveren. Kaakchirurgie, Kaakgeneeskunde, Kaakpathologie, Kaakradiologie en Endodontie). Vervolgens werden de wortelkanalen geïrrigeerd met 2 ml zoutoplossing. Het postmedicamentmonster (S3) werd op dezelfde manier verkregen als het premedicamentmonster werd verzameld en verzonden voor de PCR-analyse.

Na de laatste bemonsteringsprocedure werd de smeerlaag verwijderd door irrigatie met 5 ml 17% EDTA en vervolgens een laatste spoeling met 10 ml gedestilleerd water. De wortelkanaalbehandeling is afgerond met wortelvulling met behulp van laterale condensatie van guttapercha. Toegangsholten werden hersteld met composiethars (Z250, 3M Corporation, Saint Paul, MN, VS) en er werd een laatste röntgenfoto gemaakt.

De totale bacteriële belasting, evenals de hoeveelheid Enterococcus faecalis, werd bepaald voor instrumentatie, na instrumentatie en gebruik van de intracanale medicijnen door middel van ddPCR.

Isolatie van genomisch DNA en meting van DNA-concentratie DNA werd geëxtraheerd met behulp van de QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Duitsland) volgens het door de fabrikant aanbevolen protocol. Voorafgaand aan DNA-isolatie werden monsters (de buisjes met papieren punten) gedigereerd bij 50-60°C DOOR vortexen gedurende 30 seconden in elke 10 min om disaggregatie van alle bacteriën in de PBS-oplossing te verzekeren. Daarna werden de paperpoints aseptisch uit de suspensie verwijderd en werd de bacteriesuspensie gepelleteerd door gedurende 10 minuten te centrifugeren bij 5000 g. De pellet werd vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 180 µl buffer ATL geleverd door QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Duitsland) en 20 µl proteïnase K (20 mg/ml) werd toegevoegd. Monsters werden gedurende 3 uur bij 56°C geïncubeerd. Vervolgens werd totaal bacterieel genomisch DNA geïsoleerd volgens het protocol van de QIAamp DNA Mini Kit. Het uiteindelijke volume DNA-oplossing van elk monster was 150 μL en werd bij de berekening in aanmerking genomen. DNA-concentratie (absorptie bij 260 nm) werd bepaald met een spectrofotometer (Promega Quantifluor).

Amplificatie van 16S-rRNA-genen In dit onderzoek werden primers voor Universal- en Enterococcus 16S-rRNA-genen ontworpen. Na DNA-extractie van monsters met QIAamp DNA Mini Kit, werden 700-800 bp van 16S rRNA-sequenties geamplificeerd met behulp van universele E8F forward primer (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') en universele E1115R reverse primer (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3') 59. Het eindvolume van PCR-reacties voor elke geïsoleerde bacteriestam werd aangepast tot 25 µl. De amplificatiereacties van 16S-rRNA-genen werden uitgevoerd onder de volgende omstandigheden. 1 predenaturatiecyclus bij 95°C gedurende 3 minuten, 35 cycli van 95°C gedurende 30 seconden, 55°C gedurende 30 seconden en 72°C gedurende 30 seconden die doorgaan met een laatste verlengingsstap bij 72°C gedurende 10 minuten .

De PCR-producten werden geanalyseerd door middel van elektroforese met behulp van 2% agarosegel (bevattende ethidiumbromide) in Tris/BoratE/EDTA (TBE)-buffer, waarbij gels werden geanalyseerd onder ultraviolet licht (bij 140V gedurende 20 minuten). Hun beelden werden gevisualiseerd onder ultraviolette verlichting. Bovendien werd de controle en optimalisatie van primers voor gebruik voor ddPCR ook gedaan in conventionele PCR.

Zuivering en sequentiëring van het 16S rRNA-gen Na de PCR-reacties wordt de zuivering van PCR-producten gedaan door de overtollige primers en nucleotiden te hydrolyseren met ExoSap-IT (Thermo, PN: 78201.1.ML) dat exonuclease I en alkalische fosfatase-enzymen bevat. Voor elk monster werd 2 µl ExoSap-IT gemengd met 5 µl PCR-product. De ExoSap-reactie wordt uitgevoerd bij 37 °C gedurende 15 minuten (enzymactivering), gevolgd door 15 minuten (inactivering) bij 80 °C. Sequentiereacties werden uitgevoerd met behulp van Bigdye™ Terminator v3.1 cyclus sequencing kit (Thermo). De reacties werden uitgevoerd volgens de kithandleiding voor alle geïsoleerde stammen.

Na zuivering van de producten met Exosap werd de sequentiereactie uitgevoerd met BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo) onder de volgende omstandigheden. Na de sequentie-PCR werden BigDye-producten gezuiverd volgens de colonmethode. Voor dit proces werd Zymo ZR DNA Sequencing Clean-up Kit (Zymo Research, VS) gebruikt. Alle monsters werden gezuiverd in overeenstemming met het protocol in de kit en uitgevoerd op de 3130XL genetische analysator.

Droplet Digital PCR (ddPCR) Droplet Digital PCR (ddPCR) werd uitgevoerd met behulp van primers die waren ontworpen volgens het 16S rRNA-gebied dat specifiek is voor de totale bacteriën en Enterococcus faecalis-soorten, na sequentiebepaling, absolute kwantificering van de bacteriesoorten gevonden in het paper-point-monster. Primerparen waren 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' en 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 voor totale bacteriën en ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCCGAGT-3' en ENT-R-5'-GCCATGCGGCATAAACTG -3'-primerparen voor Enterococcus Faecalis. In de PCR-reactie werden amplicons geamplificeerd met niet-gemarkeerde primerparen geanalyseerd door labeling met Eva-Green-kleurstof. Voor absolute kwantificering van Enterococcus en totaal 16S rRNA werd PCR uitgevoerd met twee primerparen van hetzelfde monster. 20 µL PCR-mix met 10 µL 2X ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad, cat. Nee. 1864034), 9 µl nucleasevrij water, 0,25 µl zowel voorwaartse als achterwaartse primer en 2 ng DNA van elk monster. 60◦C gedurende 1 minuut en twee laatste stappen bij 4◦C gedurende 5 minuten en 90◦C gedurende 5 minuten met een oneindige hold van 4◦C. Nadat de PCR was voltooid, werd de verzegelde plaat overgebracht naar de plaathouder van de QX200 Droplet Reader (Bio-Rad, cat. Nee. 1864003).