허혈 전제 조건 - 사용의 관점 vivio/in 시험 관내 연구

스포츠와 의학에서, 조직의 기능을 수행하는 능력을 크게 향상시킬 수있는 지속적으로 새로운 방법이 검색되고 있습니다. 이러한 방법 중 하나는 스포츠에 점점 더 많이 사용되고있는 신체 활동 중 하나는 RIPC (Remot Aschemic Preconditioning)입니다. 대부분의 경우,이 절차는 사지 허혈과 재관류의 반복 된 간단한주기를 포함합니다. 그리고 종종 미래에 가능한 허혈성 에피소드의 발생에 대한 처리 된 조직의 내성을 증가시키는 데 도움이된다고합니다. 수많은 연구는 RIPC가 뇌, 심장, 간, 신장 등과 같은 숫자 기관에서 저산소증에 대한 저항력을 증가시키는 변화를 유도하는 것으로 나타났습니다.

또한, 골격근의 경우, 신체 운동을 수행하기 전에 선택된 사지의 동맥 폐색의 유도가 기능과 성능의 개선을 유발함으로써 활동에 영향을 줄 수 있다는 것이 입증되었다 (결과). 또한, 편심 수축에 의해 유발 된 손상에 대한 이러한 섬유의 더 큰 저항이 관찰되었다. 그러나이 방법의 메커니즘은 완전히 이해되지 않았으며, 그 특성은 매우 복잡 할 수 있으며 활동의 여러 단계에서 조직에 영향을 줄 수 있습니다.

다른 한편으로, 골격근은 특히 신체 활동 중에 다수의 단백질, 사이토 카인 및 저 분자량 화합물을 합성하고 방출 할 수있는 내분비기 유기임을 고려할 때, 간헐적 인 근육 허혈성 에피소드는 근육과 다른 조직의 내성을 증가시킬 수있는 요인의 방출을 초래할 것이라고 가정해야한다.

또한, 그러한 섬유 I의 적응은 대부분 전신 기능에 영향을 미치는 많은 요인의 분비와 관련이있다.

이러한 물질 중 하나는 단백질 키나제입니다. 그들은 많은 생물학적 과정의 조절뿐만 아니라 많은 암에서의 활동이 증가함에 따라 분자 적으로 표적화 된 항암 요법을 담당합니다. 이들 효소는 특정 분자의 인산화 반응을 수행한다. 인산화는 일반적으로 단백질 분자의 형태를 변화시키고 결과적으로 그 활성 및 다른 단백질에 결합하는 능력, 또는 세포 내 분자의 움직임을 변화시킨다. 대부분의 연구에 따르면 세포주기, 세포 분열, 분화 및 아 pop 토 시스와 같은 많은 기본 세포 과정에서 중요한 역할을합니다. 염색체 돌연변이, 재 배열 및 / 또는 유전자 증폭의 결과로서 키나제 활성의 탈 조절은 많은 유형의 암 세포에서 관찰된다. 따라서, 활성에 영향을 줄 수있는 RIPC 또는 집중적 인 신체 활동과 같은 절차는 이들 효소의 특정 억제제 일 수 있으며, 분자 표적 요법의 아이디어를 충족시킬 수있다. 따라서, 우리는 그것이 특정 단백질 키나제 (예 : C-Jun N- 말단 키나제 (JNK) 또는 세린-트레오닌 키나제 = 단백질 키나제 B (AKTS))에 영향을 줄 수 있으며, 특히 효과가 결합 된 경우 (RIPC + 신체 활동)에 영향을 줄 수 있다고 결론 지었다. 따라서, 우리의 파일럿 연구에서, 우리는 전립선 종양 라인 LNCAP와 관련하여 인간 혈청의 항 종양 잠재력에 대한 10 일 RIPC 절차의 효과를 평가했다. 우리는 단백질 키나제 경로에 대한 영향에 연결될 수있는 인간 혈청 항 종양 전위의 통계적 유의성 증가를 관찰했다. 그러나이를 위해서는 RIPC 절차 및 신체 활동을받는 더 많은 사람들의 인구에 대한 추가 확인 및 분석이 필요합니다. 이 연구에서 허혈 절차가 인간 혈청의 항 종양 특성에 영향을 미치는지 또는 신체 활동과 같은 다른 요인의 영향과 관련이 있는지 평가하는 것이 좋습니다.

동시에, 근력의 조건 하에서 철 대사의 변화가 발생한다는 것이 밝혀졌다. 철은 거의 모든 세포 과정에 필요한 금속이며 반면에 매우 독성이있을 수 있습니다. 반응성 산소 종 (RFT)의 형성을 자극합니다. 세포 수준에서 페리틴 단백질을 통한 유리 철의 결합은 스트레스 요인에 대한 더 큰 저항을 초래한다. 위의 고려 사항의 프리즘에서, 우리의 예비 연구의 결과는 청년의 경우에 사용 된 상지 RIPC 절차가 백혈구에서 철 대사에 변화를 일으킨다는 것을 보여줍니다. 우리는 RIPC가 WBC에서 페리틴 유전자와 단백질 수준을 증가시키는 것을 관찰했다. 페리틴 H 단백질 수준의 증가는 불안정한 철분 풀과 철 의존성 ROS 형성을 감소시키는 것으로 나타났다. 이들 데이터는 원격 허혈성 전제 조건 유도 적응 변화의 절차가 철 대사의 변화와 관련이 있음을 시사한다.

동시에, 철 대사에 대한 관심이 증가함에 따라 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 및 헵시 딘의 역할과 기능이 증가하고있다. APP는 페로 포르 틴과 함께 작동하는 단백질이므로 세포에서 철 수출에 참여하는 것으로 입증되었습니다. 또한, 앱의 번역 후 변형은 아밀로이드 α (양성 변화를 결정) 및 아밀로이드 β (음성 변화)의 형성으로 이어진다는 것이 밝혀졌다. 인체에서 아밀로이드 α의 작용의 수많은 유익한 효과가 나타났습니다 (인슐린 감수성의 증가, 신경 영양 효과, 시냅 생성의 자극)는 분비를 유도하는 방법을 찾는 경향이 있습니다. 또한, SAPPα 농도의 증가는 앱의 막 형태의 감소와 관련이있을 것이다.

APP 단백질 수준의 동일한 감소는 세포로부터 철 수출의 억제 및 세포의 농도의 증가로 이어질 것이다. 철 대사에서 이러한 변화의 특성은 RIPC 절차 동안 근육이 노출되는 허혈성 스트레스에 적응하는 것으로 간주되어야한다. 세포에서 페리틴의 증가는 유리 철의 농도를 감소시켜 철분 의존성 ROS 형성의 감소를 초래한다. 또한, 세포로부터 철 수출의 감소는 세포 외 유체 및 혈액의 농도가 감소하여 스트레스에 대한 내성을 증가시킬 수있다.

헵시 딘은 페로포르틴에 대한 억제 효과를 유발하여 위장관으로부터 철의 흡수를 제한하고 간 및 대 식세포를 포함한 인간 내 신체 시스템 자원으로부터의 방출을 제한한다. 염증 동안 혈액에서 헵시 딘의 농도가 증가합니다. 이 증가의 주요 목표는 철의 가용성을 제한하는 것인데, 이는 자유 형태로 염증 효과가 있으며 병원체의 발달을 자극 할 수있다.

저산소증 조건 하에서 머무는 것은 헵시 딘의 농도가 감소하는 것으로 나타 났으며, 이는 증가하는 적혈구에 적절한 철 공급을 보장하는 것을 목표로한다. 이러한 변화는 EPO의 증가와 관련이 있으며, 이는 적혈구를 생성 된 ERFE로 자극하고 헵시 딘 생합성을 억제 할 것이다. 결과적으로, 막사는 RIPC 절차가 헵시 딘, ERFE 및 EPO 농도에서 대체를 유도할지 여부 데이터입니다. RIPC 절차가 헵시 딘 농도에서 대체를 유도하는 경우 데이터는 없습니다. 이 상황에서 컨디셔닝 후 절차가 헵시 딘 농도와 아밀로이드 α의 형성에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 데이터는 없습니다.

비타민 D는 다수의 생리 학적 과정의 조절에 중요한 역할을한다. 그것의 활성은 주로 특정 비타민 D 수용체 (VDR)를 통해 작용하는 활성 형태 인 1,25 (OH) 2D3에 기인한다. VDR은 대략 1000 개의 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자이다. VDR은 거의 모든 인간 조직에 존재합니다 (Wang et All. 2012). 비타민 D는 자외선 (햇빛) 노출에 반응하여 피부에서 생성됩니다. 이어서, 전체 호르몬 활성을 얻기 위해 위치 25 및 1에서 하이드 록 실화된다.

반면, 25-OH 비타민 D [25 (OH) D3]는 비타민 D 상태의 좋은 마커입니다. 신장, 뇌, 뼈, 피부, 전립선 및 백혈구는 25 (OH) D3을 활성 형태로 전환 할 수 있습니다 [1,25 (OH) 2D3]. 25 (OH) D3의 낮은 혈청 수준은 이들 조직에서 활성 형태의 합성을 제한 할 것으로 예상 될 수있다. 혈청 25 (OH) D3 수준은 주로 햇빛 및 비타민 D 보충에 대한 노출에 의해 결정됩니다. 또한, 높은 지방 조직 함량은 더 낮은 혈청 25 (OH) D3 수준과 관련이 있으며, 아마도 비타민 D를 저장하는 능력 때문에 아마도 많은 운동 선수가 비타민 D 결핍이지만 더 높은 신체 활동은 비타민 D 상태와 관련이 있습니다. 종합적으로, 상기 관찰은 비타민 D 대사 산물이 중요한 생물학적 기능을 가지고 있으며, 이는 완전히 이해되는 것과는 거리가 멀다는 것을 나타낸다. 반면에, 근육 활동과 비타민 D 농도에 대한 지식이 여전히 부족했습니다. 비타민 D 상태를 유지하는 데 근육의 역할을 지적 한 주요 발견은 시험관 내 근육 세포의 특성을 연구하는 것입니다. 세포막은 단백질 메갈린 및 쿠빌린을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이들 단백질은 신장 세관 세포 및 간 성상 세포의 단백질과 마찬가지로, 세포 외 유체로부터 세포 세포질로 DBP를 수송한다.

비타민 D 결합 단백질은 2 개의 특이적이고 친 화성 결합 부위를 갖는다. 하나는 비타민 D와 그 대사 산물을위한 것이며, 가장 높은 친화력은 25 (OH) d에 대한 것입니다. 다른 결합 부위는 필라멘트 액틴에 특이 적이다. 일반적으로 보유 된 이론은 DBP의 액틴-결합 부위가 손상된 세포로부터 혈액에 방출 될 경우 액틴을 결합시키고 혈관 내 응고로부터 보호한다는 가정을 가정한다. 그러나 DBP가 골격근에서 액틴에 결합 된 것은 30 년 이상 알려져 있습니다. 내재화 된 DBP 중 일부는 특정 액틴-결합 부위를 통해 액티 오신에서 액틴에 결합 될 수 있지만, 나머지 대부분은 세포질 전체에 분산 된 액틴으로 결합된다.

그 이후로 더 많은 연구가 수행되었으며 비타민 D의 메커니즘이 점점 더 명확 해졌습니다. 그럼에도 불구하고, 비타민 D가 운동에 어떻게 영향을 미치는지는 철저히 논의되지 않았습니다. 현재, 우리는 근육 성능이 운동가에서 비타민 D 결핍을 낮추는 것을 알고 있습니다. 이러한 결과는 비타민 D가 운동 성능에 잠재적으로 영향을 미친다는 것을 간접적으로 보여줍니다. 그러나, 비타민 D가 운동으로 인한 손상을 감소시키는 지 또는 운동으로 인한 산화 스트레스는 확인이 필요합니다.

따라서 비타민 D 대사에 대한 운동의 영향을 연구하는 것이 중요합니다. 운동은 골격근으로부터의 순환으로 수백 개의 단백질 (myokine)이 방출되는 반면, 다른 조직으로부터 생물 활성 단백질 (Exerkines)의 해방을 자극합니다. 이러한 외계인의 예는 섬유 아세포 성장 인자 23이며, 운동 후 농도가 증가합니다. 이 외계인은 혈장 포스페이트 수준의 조절을 담당하며 1,25 (OH) 2D3의 형성을 억제함으로써 비타민 D 대사를 수정합니다 (Shimada et All., 2004). 따라서, 운동 후 근육 손상 수준에 대한 비타민 D 농도의 영향과 농도와 철 농도의 관계와 신체 활동 후에 발생하는 유도 된 염증 과정 사이의 관계를 평가하는 것이 중요합니다.

최근 몇 년간 세포용 DNA (CFDNA)의 시대를 부상 수준의 잠재적 바이오 마커로 가져 왔으며, 이는 운동 생리학 분야를 포함하여 많은 다양한 생물 의학 분야에 관심을 갖고 있습니다. 저항 훈련, 마라톤 달리기, 지속적인 런닝 머신 달리기, 증분 운동, 조정 운동, 강도 훈련 : 과도한 훈련 증후군의 잠재적 특징으로 cDNA의 역할을 찾는 연구가 점점 더 많아지고 있습니다.

CFDNA 외에도 격렬한 운동에 의해 유도 된 면역 기능의 관련이 있거나 유발 될 수있다. 2017 년의 간행물은 강도와 지속 시간에 따라 젖산 정상 상태 아래에서 에어로빅이 진행되는 동안에도 CFDNA 수준이 증가한 것으로 나타났습니다. CFDNA 농도는 급성 운동 직후에 정점에 도달하고 운동 후 약 1 시간이 기준 수준으로 돌아 왔습니다. 또한, 골격근 손상 (C- 반응성 단백질, 요산, 크레아틴 키나제, 미오글로빈)의 전형적인 마커는 CFDNA 피크 반응과 비교하여 지연된 동역학을 나타냅니다. 이 모든 것은 호기성과 혐기성 상태에서 운동 부하를위한 바이오 마커로서 cfDNA의 잠재력을 강조합니다. 그러나 CFDNA와 철분 상태와 운동 유도 염증 과정 사이의 상관 관계를 찾는 데 많은 노력이 없었습니다.

이 프로젝트는 원격 허혈성 전제 조건 형태의 특정 조직 영향 방법에 대한 생화학 적 반응의 메커니즘에 대한 현재의 지식 상태의 발달에 영향을 미치며, Hepcidin 및 비타민 D의 역할을 고려하여 SAPPα 및 BDNF 영양 인자의 역할 및 철 대사의 변화를 결정할 수있다. 또한, 본 프로젝트는 Anty-thumor 특성의 예로서 세포 증식에 대한 제시된 절차의 역할의 결정에 기여할 수있다.

따라서,이 프로젝트의 결과는 건강한 집단에서 허혈성 전제 조건의 역할에 대한 이해를 넓히는 중요한 단계 (운동 후 근육 손상, 세포 증식, 염증 과정을 조절 함) 및 이러한 변화에서 철 대사 및 비타민 D의 역할에 대한 지식에 대한 지식은 SAPPα, BDNF 활동에 대한 그의 관계에 대한 지식을 제공 할 것이다. 그리고 사용.

연구 프로젝트 목표

이 프로젝트는 다음을 목표로합니다.

1. 원격 허혈성 전제 조건 (RIPC)이 BDNF, 헵시 딘 및 CFDNA 농도에 영향을 미치는지 여부;
2. 단일 RIPC 세션이 SAPPα, BDNF 및 Hepcidin 농도에 영향을 미치는지, 그리고 이러한 변화가 편심 운동에 의해 유발 된 손상에 대한 골격근의 저항력이 더 큰지 여부를 나타냅니다.
3. 10 일 원격 허혈성 전제 조건에 기초한 훈련이 SAPPα, BDNF, Hepcidin erytropheron (ERFE) 및 Erythropoietin (EPO) 농도의 더 높은 변화를 유도할지 여부를 보여줍니다 (단일 RIPC 세션과 비교).
4. 순환 유리 DNA (CFDNA)가 근육 손상의 새로운 초기 단계 바이오 마커로 사용될 수 있는지 여부를 나타냅니다.
5. 단일 및 10 일 원격 허혈성 전제 조건 훈련이 비타민 D 대사 산물 농도 변화에 영향을 미치는지, 그리고 이러한 변화가 철 의존하는지 여부를 나타냅니다.
6. 비타민 D 결합 단백질 농도 (GC- 글로불린)가 단일 및 10 일 원격 허혈성 전제 조건 절차의 영향을받는 변화와 그것이 대사 산물 농도에 미치는 영향을 보여줍니다.
7. RIPC 및 신체 활동 절차가 인간 혈청 항 종양 잠재력에 미치는 영향을 보여주고 비타민 D 상태 및 철 대사와 관련이 있습니까?

가설 :

현재 지식에 기초하여 프로젝트에서 다음과 같은 가설이 언급되어 있습니다.

1. 원격 허혈성 전제 조건 (RIPC)은 SAPPα 및 BDNF의 농도를 증가시킬 것이며, 이는 손상에 대한 골격근 저항성이 높을 것이다.
2. RIPC 훈련은 SAPPα 및 BDNF의 농도를 증가시킬 것이며, 이는 단일 RIPC 세션으로 더 긴 기간 동안 지속될 것이다.
3. 비타민 D 결합 단백질, 메갈린, 큐빌린 농도 변화에 대한 신체 활동 효과.
4. RIPC 절차와 높은 VIT D 상태는 근육을 보호하고 신체 운동에 의해 유발 된 산화 스트레스를 감소시키고 높은 철 농도 (낮은 염증 과정 및 CFDNA 농도)에 의해 유발 된 산화 스트레스로부터 보호합니다.
5. RIPC 절차는 인간 LNCAP 전립선 암 세포에 대한 인간 혈청 항 종양 전위에 영향을 미칩니다.

작업 계획

연구의 목표를 달성하기 위해 60 명이 모집 된 다음 무작위로 두 그룹으로 나뉩니다.

• 실험 - 원격 허혈성 전제 그룹 (RIPC),
• 대조군 (c). 또한, 그룹은 유도 된 근육 손상 수준 및 최대 혐기성 용량 수준에 대한 일회성 및 10 배의 RIPC 영향의 가정을 구현하기 위해 하위 그룹으로 나뉩니다. 전체 연구는 실험의 가정, 즉 공백 테스트, 교차 수정 실험의 원리에 따라 수행 될 것입니다.

실험 계획 :

1. 참가자의 등록 - 의도에 근거하여 모든 훈련되지 않은 과목이 선정됩니다.

2. 실험실 측정

   1. 혐기성 검사 (Wingate anaerobic test), RIPC 1 시간, RIPC 10 번, 혐기성 검사 (Wingate anaerrobic test),
   2. 호기성 테스트 (Bruce Protocol), RIPC 1 회, RIPC 10 번, 호기성 테스트 (Bruce Protocol),
   3. 인간 혈청의 평가 (일회성 10 일 RIPC 훈련 및 위약 개체군) 인간 LNCAP 전립선 암 세포에서 항 종양 잠재력
   4. 혈액 화학 및 분자 분석
3. 결과의 분석 및 해석, 과학 간행물 준비
4. 과학 간행물 준비, 프로젝트 합의

자료 연구는 연구 포함 기준에 따라 의도적으로 선택 될 것입니다.

4.2 절차

이 연구는 6 가지 부분으로 구성됩니다.

1. 일반 건강 평가 (건강 검진) 및 상세한 연구 프로토콜에 대한 친숙 함;
2. 최대 혐기성 용량의 평가 (원하는);
3. 최대 혐기성 용량 수준에서 일회성 및 10 일 RIPC 교육 평가;
4. 시험 후 일회성 Postc 절차의 영향을 시험 한 후, 염증 반응 마커, 철 항상성, VIT D 대사 산물 및 BDNF 수준, 24 시간 휴식 후 연구 그룹에서의 SAPP α 분비 수준에 대한 시험 후에;
5. 인간 LNCAP 전립선 암 세포에 대한 인간 혈청의 평가 (일회성 10 일 RIPC 훈련 및 위약 개체군) 항 종양 잠재력;
6. 연구 중에 수집 된 혈청 및 혈장 샘플에서 선택된 실험실 지수의 평가 24 시간, 48 시간, 72 시간 및 120 시간의 편심 운동에 의해 유도 된 근육 손상 에피소드에서;

각 참가자는 수화 상태에 있으며 아침 시간에 첫 식사 전에 (8 : 00-9 : 00 A.M.)됩니다. 적절한 조치를 취하기 전에 각 참가자는 일주일 전에 모든 절차에 대한 친숙한 세션을 가졌습니다.

RIPC 절차에 대한 자세한 설명에 따라 원하는 연습 절차 및 근육 손상이 시작되기 전에 허혈 절차가 수행됩니다. 부유 플랜지의 4 배 충전물은 초기 직선 허벅지 근육의 부착 근처에서 5 분의 휴식 간격으로 200mm Hg의 값에 대해 5 분 씩 수행됩니다. 수행 된 모든 절차는 전체 동맥 혈류 제한을 수행하기 위해 도플러 USG 컨트롤 하에서 수행됩니다.

4.4하지의 혐기성 혐기성 힘의 측정 (wingate 혐기성 테스트)이 변위 측정의 혐기성 파워에 대한 윙이트 혐기성 혐기성 시험 (WANT)은 사이클 에르고 미터 (MANARK 894E, 스웨덴의 피크 바이크)에서 수행 될 것입니다. 각 참가자의 경우 안장 높이가 개별적으로 조정되어 하향 스트로크 무릎 각도가 약 170-175 °가되도록합니다. 실험 테스트 전에 각 개인은 60 rpm 및 1W/kg의 템포로 사이클 에르고 미터에서 5 분 워밍업을 수행합니다. 5 분 휴식 후, 각 참가자는 총 체질량 75 g/kg의 고정 저항 부하에 대해 30 초 동안 최대한의 페달을 밟도록 요청받습니다. 각 참가자는 가능한 빨리 순환하도록 지시 받았으며, 세트 저항을 적용하기 전에 3S 카운트 다운을 받았습니다. Cyclo Ergometer의 데이터는 MCE 5.1 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터를 통해 기록됩니다.

변수는 절대 값 (W) 및 체질량 (w/kg)으로 분석됩니다.

4.5 혈액 샘플 수집 및 측정

진단 테스트를위한 혈액 수집 방법론은 특정 명칭의 요구 사항에 엄격히 의존하고 연구 절차 (문헌 데이터를 기반으로 설정)를 준수합니다. 실험실 분석의 경우 말초 혈액이 수집됩니다. 계획에 따라 :

• 원하는 경우 : 한 번 및 10 일 RIPC- 신체 운동 전 (이른 아침, 식사없이), Wingate 테스트 완료 직후 (시험 후 최대 5 분), 윙이트 테스트 완료 후 30 분 (시험 후 30-35 분), 60 분, 6 시간 후, 24 시간 후 24 시간

섭취량은 자격을 갖춘 의료진이 적절한 표준화 된 튜브에서 수행됩니다.

혈청 및 혈장은 샘플에서 분리됩니다. homoeostasis 상태의 일반적인 평가는 예비 실험실 테스트를 기반으로합니다. 항산화 방어 방어 웨스턴 블 롯팅 기술에 관여하는 단일 단백질의 질적 검출을 위해 수행 될 것이다.

CFDNA 분석의 경우 : 혈액은 시험 종료 직후, 운동 종료 직후 5 분 60 분 후에 (아침, 공복에) 신체 운동 전에 (아침, 공복에) 세포가없는 DNA 튜브로 수집됩니다. 수집 된 재료는 냉장고 나 CFDNA 분리를 위해 얼음에 저장됩니다.

CFDNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 Quick-CFDNA 혈청 및 플라즈마 키트를 사용하여 세포가없는 DNA 튜브로 수집 될 것입니다. 획득 된 재료는 분취니다, -200C에 저장 한 후 추가 분석에 사용됩니다.

제안 된 모든 면역 접합 성 절차는 이용 가능한 및 표준화 된 방법을 사용하여 수행 될 것이다. 대부분은 Immunoenzyme 방법 (ELISA) 또는 Luminex Systems Multiplexing Unit에 의해 지정됩니다. ELISA 시험은 모노 또는 폴리 클로 날 공액 효소 항체를 사용하여 시험 물질에서 특정 단백질을 검출하는데 사용된다. 기성품 시약 ELISA 키트가 사용됩니다. 최종 생성물의 농도는 흡수를 측정하고 표준 용액과 비교함으로써 평가 될 것이다. 읽기는 ELISA Thermo Scientific Microplate Reader 및 Magpix Xponent 4.2 시스템, Ruo에서 이루어질 것입니다.

비타민 D 대사 산물 농도는 탠덤 질량 분석법 (QTRAP®4500 (SCIEX) SH와 함께 Exionlc HPLC 시스템과 결합 된 액체 크로마토 그래피를 사용하여 수행 될 것이다. 혈청 샘플은 전기 분무 이온화를 사용하여 양성 이온 모드에서 분석 될 것이다. 원시 데이터는 LabSolutions LCGC를 사용하여 수집됩니다. 수집 된 데이터를 처리하고 정량화하기 위해 LabSolutions LCGC도 사용됩니다. 다음 VIT. D 대사 산물이 결정될 것이다 : 25 (OH) D3, 24,25 (OH) 2D3, 3-EPI-25 (OH) D3 및 25 (OH) D2 수준; 및 25 (OH) D3 내지 24,25 (OH) 2D3 및 25 (OH) D3 내지 3-EPI-25 (OH) D3의 비율.

SAPPα 농도를 결정하려면 인간 혈장에서 알부민을 완전히 제거해야합니다. 초기 예비 시험은이 ELISA의 선형성 및 민감도가 수정되지 않은 인간 혈장의 높은 단백질 함량으로 인한 비특이적 결합으로 인해 차선책임을 밝혀 냈습니다. 따라서, 모든 혈장 샘플은 분석 전에 HSA- 면역 구매를해야한다. SAPPα ELISA 수준은 총 SAPP 웨스턴 신호 (상대 단위)로 정규화되어야합니다. 절차는 HSA 스피넬 컬럼 (Phenomenex, Torrance, CA)을 기반으로 인간 프로테오멜 랩 Igy 알부민을 사용하여 인간 혈청 알부민을 고갈시켜 혈청 전임을 포함합니다. 절차는 정제 된 샘플의 단백질 함량을 결정하기 위해 웨스턴 블롯 방법의 예비 적용에 의해 확인 될 것이다. SAPPα 수준은 ELISA 방법 인 Immunobicological Laboratories, Gum, Japan을 사용하여 결정됩니다.

단백질 정 성적 탐지의 경우 웨스턴 블 롯팅 기술이 수행됩니다. 샘플은 단백질 변성을 겪고 겔 전기 영동을 겪게된다. 합성 또는 항체 (1 차 항체)는 특정 표적 단백질을 인식하고 결합한다.

과량의 항체를 세척하기 전에 전기 영동 막을 1 차 항체를 함유하는 용액으로 세척 하였다. 1 차 항체를 인식하고 결합하는 이차 항체가 첨가된다. 2 차 항체는 염색, 면역 형광 및 방사능과 같은 다양한 방법을 통해 시각화되어 특정 표적 단백질의 간접 검출을 허용한다.

4.6. 세포 독성 활동 세포주 및 배양 조건. LNCAP 세포주는 10% 태아 소 혈청 (FBS) (브라질, 브라질), 100 U/mL의 페니실린 및 100 μg/mL의 스트렙토 마이신이 보충 된 RPMI 1640 배지 (Gibco; Rockville, MD)에서 배양 될 것이며, 37 ° C 및 5% Co2에서 습기 화 된 분위기에서 배양 될 것이다. 세포 독성 활성은 평가 될 것이다 : 세포는 37 ° C 및 5% CO2에서 허마 대기에서 24 시간 동안 EEHS (25-200 μg/ml)의 존재하에 10% FBS가 보충 된 RPMI 1640 중 96- 웰 미세도 (105 세포/mL)에 도금 하였다. 이 기간 후, 세포를 PBS로 세척하고 완충제 (0.01 M Hepes, pH = 7.4, 0.14M NaCl 및 2.5 mM CaCl2)에 재현 탁시켰다. 염색 된 세포는 정확하게 표지되고 정확하게 표지되고 Accuri C6 유세포 분석기 및 특정 소프트웨어를 사용하여 분석 될 것이다.

4.7 통계 분석 결과는 Statistica 소프트웨어를 사용하여 통계적으로 분석됩니다. 통계적 유의성은 p <0.05에 대해 결정될 것이다. 이 프로젝트는 그룹 간의 결과, 욕구 및 실험실 매개 변수의 차이의 중요성을 분석합니다. 원하는 후 변화의 중요성 및 테스트 결과의 회귀 분석.

변수의 정규 분포 (Shapiro-Wilk 테스트)에 따라 분산의 동질성 기준 (Levene 's Test)에 따라 파라 메트릭 또는 비모수 적 테스트가 수행됩니다. 생화학 적 마커의 폴드 변화에 대한 통계 테스트를 평가하기 위해 로그 2로 변환됩니다.