Iskæmisk forkonditionering - Perspektiver på brug vivio/in vitro -undersøgelser

Både inden for sport og medicin søger konstant nye metoder, der kan forbedre vævets evne til at udføre deres funktioner markant til at udføre deres funktioner. En af sådanne metoder, der i stigende grad blev brugt i sport, er en fysisk aktivitet den fjernt iskæmiske forkonditionering (RIPC). I de fleste tilfælde involverer denne procedure gentagne korte cyklusser af lemmer iskæmi og reperfusion. Og ofte siges det, at det hjælper med at øge tolerancen for behandlede væv til forekomsten af mulige iskæmiske episoder i fremtiden. Talrige undersøgelser har vist, at RIPC inducerer ændringer, der fører til øget resistens over for hypoxi og mange andre vævsstressorer i numerusorganer, såsom hjerne, hjerte, lever, nyrer osv.

I tilfælde af knoglemuskler er det desuden bevist, at induktion af arteriel okklusion i den del af udvalgte lemmer, før de udfører fysiske øvelser, kan påvirke dens aktivitet ved at forårsage forbedring af dens funktion og ydeevne, og dermed kan resultere i en sportsresultater (resultater). Derudover blev der observeret en større modstand fra sådanne fibre til skade induceret af excentriske sammentrækninger. Mekanismen for denne metode er imidlertid ikke fuldt ud forstået, og dens karakter kan være meget kompliceret og virkningsvæv på mange stadier af dens aktivitet.

På den anden side i betragtning af at skeletmuskelen er et endokrine organ, der er i stand til at syntese og frigive et antal proteiner, cytokiner og forbindelser med lav molekylvægt, især under fysisk aktivitet, bør det antages, at denne intermitterende muskeliskæmiske episoder vil føre til øget frigivelse af faktorer, der øger modstanden for muskler og andre væv til stress.

Derudover er tilpasning af sådanne fibre for det meste forbundet med sekretionen af mange faktorer, der påvirker hele kropsfunktionen.

Et af sådanne stoffer er proteinkinaser. De er ansvarlige for regulering af mange biologiske processer såvel som en molekylært målrettet anti-kræftbehandling på grund af det øgede niveau, dets aktivitet i mange kræftformer. Disse enzymer udfører phosphoryleringsreaktionen af en specifik molekyler. Phosphorylering ændrer normalt konformationen af proteinmolekylerne og ændrer følgelig dens aktivitet og evne til at binde til andre proteiner eller bevægelsen af molekylet i cellen. De fleste undersøgelser viser, at de spiller en nøglerolle i mange grundlæggende cellulære processer, såsom cellecyklus, celledeling, differentiering og apoptose. Deregulering af kinaseaktivitet som et resultat af kromosomale mutationer, omarrangementer og / eller genamplifikation observeres i mange typer kræftceller. Derfor kan sådanne procedurer som RIPC eller intensiv fysisk aktivitet, der kan påvirke dets aktivitet, være specifikke hæmmere af disse enzymer, hvilket opfylder ideen om molekylær målrettet terapi. Derfor konkluderer vi, at det kan påvirke nogle specifikke proteinkinaser (sådan som c-Jun N-terminale kinaser (JNK'er) eller serin-threoninkinase = proteinkinase B (AKTS)) og kan være forbundet med kræftcellers liv, især hvis effekten kombineres sammen (RIPC + fysisk aktivitet). I vores pilotundersøgelser vurderede vi derfor virkningen af den 10 dage RIPC-procedure på antitumorpotentialet for humant serum i forhold til prostatatumorlinjen LNCAP. Vi observerede statistisk signifikansforøgelse af humant serum antitumorpotentiale, som kan være forbundet til virkningen på proteinkinaseveje. Dette kræver imidlertid yderligere bekræftelse og analyser af en større population af mennesker, der blev udsat for RIPC -proceduren og fysisk aktivitet. Fra denne forskning synes det at være tilrådeligt at vurdere, om de iskæmiske procedurer påvirker antitumoregenskaber af humant serum i sig selv, eller er det forbundet med virkningen af andre faktorer som fysisk aktivitet.

På samme tid blev det bemærket, at under betingelser med muskelstress -inducerede ændringer i jernmetabolisme forekommer. Jern er et metal, der er nødvendigt for næsten alle celleprocesser, og på den anden side kan det være meget giftigt - stimulere dannelsen af reaktive iltarter (RFT). Binding af frit jern gennem ferritinproteinet på celleniveau fører til dets større modstand mod stressfaktorer. I prisme af ovenstående overvejelser forårsager resultaterne af vores foreløbige undersøgelser, at de øvre lem RIPC -procedurer anvendt i tilfælde af unge mænd forårsager ændringer i jernmetabolisme i hvide blodlegemer. Vi observerede, at RIPC øger ferritingener og proteinniveau i WBC. Stigning i ferritin H-proteinniveau viste sig at reducere labil jernpool og jernafhængig ROS-dannelse. Disse data antyder, at proceduren for fjern iskæmisk forkonditionering inducerede adaptive ændringer er forbundet med ændringer i jernmetabolisme.

På samme tid øges med den stigende interesse for jernmetabolismen, at amyloidforstadiets protein (APP) og hepcidin er. Det er bevist, at APP er et protein, der fungerer med ferroportin, og dermed deltager i jerneksport fra en celle. Desuden er det vist, at den post-translationelle modifikation af APP fører til dannelsen af amyloid a (bestemmer positive ændringer) og amyloid ß (negative ændringer). Talrige fordelagtige virkninger af virkningen af amyloid α i den menneskelige krop er vist (stigning i insulinfølsomhed, neurotrofisk virkning, stimulering af synaptogenese) har en tendens til at søge metoder til induktion af dens sekretion. Derudover vil en stigning i SAPPa -koncentration være forbundet med et fald i membranformen af APP.

Det samme fald i APP -proteinniveauet vil føre til inhibering af jerneksport fra cellen og forøgelse af dens koncentration i cellen. Arten af sådanne ændringer i jernmetabolisme skal betragtes som et tilpasningsdygtige til den iskæmiske stress, som muskler udsættes for under RIPC -proceduren. Stigningen i ferritin i cellen fører til et fald i koncentrationen af frit jern og dermed en reduktion i jernafhængig ROS -dannelse. Derudover vil reduktionen af jerneksport fra cellen føre til et fald i dens koncentration i den ekstracellulære væske og blod, hvilket også kan øge tolerancen for stress.

Hepcidin inducerer en undertrykkende effekt på ferroportin, hvilket begrænser absorptionen af jern fra mave-tarmkanalen såvel som dens frigivelse fra intra-human kropssystemressourcer, herunder lever og makrofager. Koncentrationen af hepcidin i blodet øges under betændelse. Det ser ud til, at hovedmålet med denne stigning er at begrænse tilgængeligheden af jern, som i den frie form har en pro-inflammatorisk virkning og kan stimulere udviklingen af patogener.

Det er hidtil vist, at ophold under hypoxia -forhold fører til et fald i koncentrationen af hepcidin, som sigter mod at sikre tilstrækkelig forsyning af jern til den stigende erythropoiesis. Disse ændringer er forbundet med stigning i EPO, som vil stimulere erythroblaster til produceret ERFE, og det vil hæmme hepcidin -biosyntesen. Til gengæld er kasernen data om, hvorvidt RIPC -proceduren vil inducere substitution i hepcidin, ERFE og EPO -koncentration. Til gengæld er der ingen data, hvis RIPC -proceduren vil inducere substitution ved Hepcidin -koncentrationen. Tilsvarende er der ingen data, hvordan i denne situation postkonditioneringsprocedure kan påvirke hepcidinkoncentrationen og dannelsen af amyloid a.

D -vitamin spiller en afgørende rolle i reguleringen af flere fysiologiske processer. Dens aktivitet tilskrives hovedsageligt den aktive form, 1,25 (OH) 2D3, der virker via en specifik vitamin D -receptor (VDR). VDR er en transkriptionel faktor, der regulerer ekspressionen af ca. 1000 gener. VDR er til stede i næsten alt menneskeligt væv (Wang et alle. 2012). D -vitamin produceres i huden som respons på ultraviolet eksponering (sollys). Derefter hydroxyleres det i positioner 25 og 1 for at få fuld hormonel aktivitet.

På den anden side er 25-OH vitamin D [25 (OH) D3] en god markør for D-vitaminstatus. Nyren, hjerne, knogler, hud, prostata og hvide blodlegemer kan konvertere 25 (OH) D3 til sin aktive form [1,25 (OH) 2D3]. Det kan forventes, at lave serumniveauer på 25 (OH) D3 vil begrænse syntesen af den aktive form i alle disse væv. Serum 25 (OH) D3 -niveauer bestemmes hovedsageligt af eksponeringen for sollys og D -vitamintilskud. Derudover er indholdet med højere fedtvæv forbundet med lavere serum 25 (OH) D3-niveauer, muligvis på grund af dets evne til at opbevare vitamin D. På den anden side er højere fysisk aktivitet forbundet med bedre D-vitamin-status, selvom mange atleter er D-vitamin-mangel. Samlet indikerer ovenstående observationer, at D -vitamin -metabolitter har vigtige biologiske funktioner, som langt fra er helt forstået. På den anden side var der stadig mangel på viden om muskelaktivitet og D -vitamin -koncentration. Den vigtigste opdagelse, der pegede på en rolle for muskler til at opretholde D -vitaminstatus, kom fra at studere egenskaberne ved muskelceller in vitro. Cellemembranen viste sig at indeholde proteinerne megalin og cubilin. Disse proteiner, som dem i nyre tubulusceller og i lever -stellatceller, transporterer DBP fra den ekstracellulære væske ind i cellecytoplasmaet.

Det vitamin D-bindende protein har to specifikke bindende steder med høj affinitet. Den ene er til D -vitamin og dets metabolitter, hvor den højeste affinitet er for 25 (OH) d. Det andet bindingssted er specifikt for filamentøs actin. En almindeligt holdt teori postulerer, at Actin-bindende sted for DBP fungerer til at binde actin, hvis de frigøres i blod fra beskadigede celler og dermed beskytter mod intravaskulær koagulation. Alligevel har det været kendt i over 30 år, at DBP bliver bundet til actin i knoglemuskler. Nogle af de internaliserede DBP kunne være bundet til actin i actomyosin via dets specifikke actin-bindende sted, men meget af resten er bundet til actin spredt i hele cytoplasmaet.

Siden da er der blevet udført mange flere undersøgelser, og mekanismerne til D -vitamin er blevet mere og mere klare. Ikke desto mindre, hvordan D -vitamin påvirker træning, ikke er blevet grundigt diskuteret. I øjeblikket ved vi, at muskelpræstation sænker D -vitaminmangel hos træner. Disse resultater viser indirekte, at D -vitamin potentielt påvirker træningsydelse; Hvorvidt D-vitamin reducerer træningsinduceret skade eller den oxidative stress forårsaget af træning kræver imidlertid bekræftelse.

Derfor er det vigtigt at undersøge virkningen af træning på D -vitamin -metabolisme. Træning stimulerer frigivelsen af flere hundrede proteiner (myokiner) i cirkulationen fra knoglemusklen, samtidig med at de stimulerer frigørelsen af bioaktive proteiner (exerkines) fra andre væv. Et eksempel på sådan exerkine er fibroblastvækstfaktor 23, hvis koncentration øges efter træning. Denne exerkine er ansvarlig for reguleringen af plasmaposfatniveauer og ændrer D -vitamin -metabolisme ved at hæmme dannelsen af 1,25 (OH) 2D3 (Shimada et All., 2004). Derfor synes det vigtigt at vurdere virkningen af D-vitamin-koncentration på niveauet for muskelskade efter træning og forholdet mellem dets koncentration og jernkoncentration og den inducerede inflammatoriske proces, der forekommer efter fysisk aktivitet.

I de seneste år bragte æraen med cellefrit DNA (CFDNA) som en potentiel biomarkør for skadesniveauet, som får interesse for mange forskellige biomedicinske discipliner, herunder området for træningsfysiologi. Der er flere og flere undersøgelser på udkig efter rollen som cDNA som et potentielt kendetegn for overtræningssyndromet i: modstandstræning, maratonkørsel, kontinuerlig løbebåndskørsel, trinvis træning, rodøvelse, styrketræning.

Udover cfDNA kan være relateret til eller udløse tilpasninger af immunfunktion induceret af anstrengende træning. Publikation fra 2017 afslørede en stigning i cfDNA -niveau, selv under aerob, der kører under laktatets stabile tilstand, afhængigt af intensitet og varighed. Det blev observeret, at cfDNA-koncentrationer toppede sig umiddelbart efter akut træning, og ca. 1 timer efter træning vendte tilbage til baseline-niveauer. Endvidere viser typiske markører for skeletmuskelskade (C-reaktivt protein, urinsyre, kreatinkinase, myoglobin) forsinket kinetik sammenlignet med cfDNA-spidsresponsen. Alt dette understreger potentialet for cfDNA som en biomarkør for træningsbelastning i både aerobe og den anaerobe tilstand. Der var dog ikke meget indsats for at finde sammenhængen mellem cfDNA og jerntilstand og øvelser inducerede betændelsesproces.

Dette projekt vil have indflydelse på udviklingen af den aktuelle videnstilstand om mekanismerne for biokemisk respons på specifik væv, der påvirker metoden i form af en fjern iskæmisk forkonditionering og giver mulighed for at bestemme rollen som Sappa og BDNF -trofiske faktorer og ændringer i jernmetabolisme i denne proces under hensyntagen til rollen for hepcidin og vitamin D. Desuden kan det nuværende projekt bidrage til bestemmelsen af de præsenterede procedurer for celler på cellers spredning, som eksempel på antry-tumorejer.

Derfor kan resultaterne af dette projekt være et betydeligt skridt i at udvide forståelsen af rollen som iskæmisk forkonditionering i den sunde befolkning (ved modulering af muskelskader efter træning, cellers proliferation, betændelseproces) og rollen af jernmetabolisme og vitamin d i disse ændringer, der tilføjer, vil viden om den beskyttende virkning af ripc-procedurer og deres forhold til SAPPa, BDNF-ændringer og protein kin-aktivitet give over for den gennemførelse af dens relevante aktivitet af dens nye aktivitet og brug.

Forskningsprojektmål

Projektet sigter mod:

1. Demonstration, om fjerntliggende iskæmisk forkonditionering (RIPC) vil påvirke BDNF, Hepcidin og CFDNA -koncentrationen;
2. Angiv, hvorvidt og hvor længe enkelt RIPC -session vil påvirke SAPPa, BDNF og Hepcidin -koncentrationen, og om disse ændringer vil blive ledsaget af større resistens af skeletmuskler til skade induceret af excentriske øvelser;
3. Vis, om træning baseret på en 10-dages fjernbetjening iskæmisk forkonditionering vil inducere en højere ændring af SAPPa, BDNF, hepcidin erytropheron (ERFE) og erythropoietin (EPO) koncentration (sammenlignet med en enkelt RIPC-session);
4. Angiv, om cirkulerende frit DNA (CFDNA) kan bruges som en ny biomarkør for tidlig fase af muskelskade og træning overbelastning af durin anaerob aktivitet.
5. Angiv, om enkelt- og 10-dages fjerntliggende iskæmisk forkonditioneringstræning påvirker D-vitamin-metabolitterkoncentrationsændringer, og om disse ændringer er jernafhængige.
6. Demonstrere om, hvorvidt D-vitaminbindende proteinkoncentration (GC-Globulin) ændrer sig under påvirkning af enkelt- og 10-dages fjerntliggende iskæmisk forkonditioneringsprocedurer, og hvordan det påvirker Vit D-metabolitterkoncentration.
7. Vis, hvordan RIPC- og fysiske aktivitetsprocedurer påvirker humant serum antitumorpotentiale, og er det forbundet med D-vitaminstatus og jernmetabolisme

Hypoteser:

I projektet på grundlag af den aktuelle viden er følgende hypoteser angivet:

1. Fjern iskæmisk forkonditionering (RIPC) vil øge koncentrationen af SAPPa og BDNF, hvilket vil korrelere med højere skeletmuskelresistens over for skader;
2. RIPC -træning vil øge koncentrationen af SAPPa og BDNF, som vil vedvare over en længere periode, der kommer til en enkelt RIPC -session;
3. Effekter af fysisk aktivitet på D -vitaminbindende protein, megalin, cubilinkoncentrationsændringer.
4. RIPC -procedurer og høj VIT D -status beskytter musklerne og reducerer oxidativ stress induceret af fysisk træning og beskytter mod oxidativ stress induceret af høj jernkoncentration (lavere inflammationsproces og cfDNA -koncentration).
5. RIPC-procedurer påvirker humant serum-antitumorpotentiale mod humane LNCAP-prostatacancerceller.

Arbejdsplan

For at nå målene for undersøgelsen vil 60 personer blive rekrutteret, derefter tilfældigt opdelt i to grupper:

• Eksperimentel - fjerntliggende iskæmisk precondictioning -gruppe (RIPC),
• Kontrolgruppe (C). Endvidere vil grupper blive opdelt i undergrupper for at implementere antagelserne om engangs- og 10 gange RIPC-påvirkning af niveauet for en induceret muskelskade og niveauet for maksimal anaerob kapacitet. Hele undersøgelsen vil blive udført ved hjælp af antagelserne om eksperimentet - en tom test og i overensstemmelse med principperne for krydsbefrugtningseksperimentet.

Eksperimentplan:

1. Tilmelding af deltagerne - Alle utrente emner vælges på grundlag af intentionbrevet.

2. Laboratoriemålinger

   1. Anaerob test (Wingate Anaerobic Test), RIPC 1 gang, RIPC 10 gange, anaerob test (Wingate Anaerobic Test),
   2. Aerobtest (Bruce Protocol), RIPC 1 gang, RIPC 10 gange, aerob test (Bruce Protocol),
   3. Evaluering af humant serum (fra engangs, ti-dages RIPC-træning og placebo-populationer) antitumorpotentiale på humane LNCAP-prostatacancerceller
   4. Blodkemi og molekylær analyse
3. Analyse og fortolkning af resultater, forberedelse af videnskabelige publikationer
4. Forberedelse af videnskabelige publikationer, projektafvikling

Materiale Undersøgelsen vil blive brugt målrettet selektion i henhold til undersøgelseskriterierne for undersøgelsesindeslutning.

4.2 Procedurer

Undersøgelsen vil bestå af seks dele:

1. vurdering af generel sundhed (medicinsk undersøgelse) og fortrolighed med detaljeret undersøgelsesprotokol;
2. vurdering af den maksimale anaerobe kapacitet (ønsker);
3. Evaluering af engangs- og ti-dages RIPC-træning på niveau med maksimal anaerob kapacitet;
4. Evaluering af virkningen af engangs POSTC-procedure efter ønsker testning på niveau med inflammatoriske responsmarkører, jernhomeostase, vit D-metabolitter og BDNF, SAPP α-sekretion i forskningsgrupper efter 24 timers hvile fra WIST-test;
5. Evaluering af humant serum (fra engang, ti-dages RIPC-træning og placebo-populationer) antitumorpotentiale på humane LNCAP-prostatacancerceller;
6. Evaluering af udvalgte laboratorieeksponenter i serum- og plasmaprøver indsamlet i løbet af undersøgelsen 24 timer, 48 timer, 72 timer og 120 timer fra en episode af muskelskade induceret af excentriske øvelser;

Hver deltager vil være i hydreret tilstand og inden deres første måltid i morgentimerne (8: 00-9: 00 a.m.). Før ordentlige foranstaltninger havde hver deltagere en uge tidligere en fortrolighed med alle procedurer.

Den iskæmiske procedure vil blive udført inden starten af de ønsker- og excentriske øvelsesprocedurer og muskelskader i overensstemmelse med den detaljerede beskrivelse af RIPC -proceduren. Fire gange fyldning af flotationsflangen udføres med 5 minutter til værdien på 200 mm Hg med 5 minutters hvileinterval nær fastgørelsen af den indledende lige lårmuskel. Alle udførte procedurer vil blive udført under Doppler USG -kontrol for at udføre fuld arteriel blodstrømbegrænsning.

4.4 Måling af anaerobe effekt i underekstremiteterne (Wingate Anaerobic Test) til anaerob effekt i underekstremiteten målevinge anaerob test (ønsker) vil blive udført på et cyklus ergometer (Monark 894E, peak cykel fra Sweden). For hver deltager justeres sadelhøjden individuelt, så det efter det nedadgående slagknævinklen er cirka 170-175 °. Før enhver eksperimentel test udfører hvert individ en opvarmning på 5 minutter på cyklus-ergometeret med tempo på 60 o/min og 1W/kg. Efter fem minutters pause bliver hver deltager bedt om at pedalere med maksimal indsats i en periode på 30 sekunder mod en fast resistiv belastning på 75 g/kg total kropsmasse. Hver deltager blev bedt om at cykle så hurtigt som muligt og fik en 3S -nedtælling, før den indstillede modstand blev anvendt verbal opmuntring vil blive givet til alle deltagere til at opretholde deres højest mulige kadence under hele mangel. Data fra Cyclo Ergometer registreres via computer med MCE 5.1 -softwaren.

Variabler vil blive analyseret som absolutte værdier (W) og i forhold til kropsmasse (W/kg).

4.5 Blodprøver Indsamling og målinger

Metodikken for blodopsamling til diagnostiske tests vil være strengt afhængig af kravene til en bestemt betegnelse og overholde forskningsprocedurerne (etableret på grundlag af litteraturdata). Til laboratorieanalyse indsamles perifert blod. I overensstemmelse med planen:

• For mangel: For én gang og 10-dages RIPC-før fysisk træning (i den tidlige morgen, uden et måltid), umiddelbart efter afslutningen af Wingate-testen (op til 5 minutter efter testen), efter 30 minutters hvileperiode efter afslutningen af Wingate-testen (30-35 minutter efter test

Indtagelsen udføres i passende standardiserede rør af kvalificeret medicinsk personale:

Serum og plasma vil blive adskilt fra prøverne. Den generelle vurdering af homoeostase -staten vil være baseret på foreløbige laboratorieundersøgelser. Til den kvalitative detektion af enkeltproteiner, der er involveret i antioxidantforsvar Western blotting -teknik, udføres.

Til cfDNA-analyse: blod opsamles i cellefrie DNA-rør før fysisk træning (om morgenen, på tom mave), umiddelbart efter afslutningen af forsøget, 5 minutter og 60 minutter efter træningens afslutning. Indsamlet materiale opbevares i et køleskab eller på is til cfDNA -isolering.

CFDNA opsamles i cellefrie DNA-rør og isoleres ved hjælp af Quick-CFDNA-serum & plasma-kit i henhold til producentens protokol. Opnået materiale vil blive alikvoteret, opbevaret i -200C og derefter brugt til yderligere analyser.

Alle foreslåede immunoenzymatiske procedurer vil blive udført ved hjælp af tilgængelige og standardiserede metoder. De fleste vil blive betegnet ved immunoenzymmetoden (ELISA) eller Luminex Systems multiplexing -enhed. ELISA -testen bruges til at detektere specifikke proteiner i testmaterialet ved anvendelse af mono- eller polyklonal konjugeret enzymantistoffer. Klare reagens ELISA-sæt vil blive brugt. Koncentrationen af det endelige produkt vurderes ved at måle absorptionen og sammenligne med standardopløsningen. Læsningerne foretages på ELISA Thermo Scientific Microplate Reader og Magpix Xponent 4.2 System, Ruo.

D -vitamin -metabolitterkoncentration udføres under anvendelse af væskekromatografi kombineret med tandem -massespektrometri (QTRAP®4500 (SCIEX) SH kombineret med exionlc HPLC -system). Serumprøver analyseres i den positive iontilstand ved anvendelse af elektrosprayionisering. De rå data indsamles ved hjælp af labsolutions LCGC. For at behandle og kvantificere de indsamlede data vil Labsolutions LCGC også blive brugt. Følgende Vit. D Metabolitter bestemmes: 25 (OH) D3, 24,25 (OH) 2D3, 3-EPI-25 (OH) D3 og 25 (OH) D2-niveauer; og forholdet på 25 (OH) D3 til 24,25 (OH) 2D3 og 25 (OH) D3 til 3-EPI-25 (OH) D3.

For at bestemme SAPPa -koncentrationen vil det være nødvendigt at fjerne albumin fra humant plasma fuldstændigt. De indledende foreløbige tests afslørede, at lineariteten og følsomheden af denne ELISA er suboptimal på grund af ikke-specifik binding, der tilskrives det høje proteinindhold i umodificeret humant plasma. Derfor skal alle plasmaprøver skal være HSA-immunosubacted før analyse. SAPPa ELISA -niveauer skal derefter normaliseres til totale Sapp -vestlige signaler (relative enheder). Proceduren involverer serumforfraktion ved at udtømme humant serumalbumin ved hjælp af human proteomelab iGY-albumin baseret på en HSA-spinelsøjle (Phenomenex, Torrance, CA). Proceduren vil blive bekræftet ved foreløbig anvendelse af Western blot -metoden til at bestemme proteinindholdet i prøverne, der blev udsat for oprensning. SAPPa -niveauer bestemmes ved hjælp af ELISA -metoden - Immunobiological Laboratories, Gum, Japan.

Til protein -kvalitativ detektion vil Western blotting -teknik blive udført. Prøven vil gennemgå protein -denaturering efterfulgt af gelelektroforese. Et syntetisk eller antistof (primært antistof) genkender og binder til et specifikt målprotein.

Elektroforese -membranen vaskes i en opløsning, der indeholder det primære antistof, før overskydende antistof vaskes af. Et sekundært antistof tilsættes, der genkender og binder til det primære antistof. Det sekundære antistof visualiseres ved forskellige metoder, såsom farvning, immunofluorescens og radioaktivitet, hvilket tillader indirekte detektion af det specifikke målprotein.

4.6. Cytotoksiske aktivitetscellelinjer og kulturbetingelser. LNCAP -cellelinjen dyrkes i RPMI 1640 Medium (Gibco; Rockville, MD, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Cultilab, Brasilien), 100 U/ml af penicillin og 100 μg/ml streptomycin, og den blev inkuberet i en befugtet atmosfære ved 37 ° C og 5% CO2. Den cytotoksiske aktivitet vil blive evalueret: celler blev udpladet på 96-brønds mikroplader (105 celler/ml) i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS i fravær eller tilstedeværelse af EEHS (25-200 μg/ml) i 24 timer i en befugtet atmosfære ved 37 ° C og 5% CO2. Efter denne periode blev cellerne vasket med PBS og resuspenderet i puffer (0,01 M HEPES, pH = 7,4, 0,14 M NaCI og 2,5 mM CaCl2). De farvede celler vil blive fluorescerende mærket og analyseret ved hjælp af et nøjagtigt C6 -flowcytometer og specifik software.

4.7 Statistisk analyse Resultaterne analyseres statistisk ved hjælp af Statistica -software. Statistisk signifikans vil blive bestemt for P <0,05. Projektet analyserer betydning af forskelle i resultater, ønsker og laboratorieparametre mellem grupper; Betydning af ændringer efter mangel på og regressionsanalyse af testresultater.

Afhængig af den normale distribution (Shapiro-Wilk-test) af variablerne og opfyldelse af kriterierne for homogenitet af afvigelser (Levene's test) udføres den parametriske eller ikke-parametriske test. For at evaluere den statistiske test for foldeskift af de biokemiske markører vil den blive transformeret Log2.