Niedokręgowe warunki wstępne - perspektywy użytkowania Vivio/in vitro badania

Zarówno w sporcie, jak i medycynie, są ciągle nowe metody, które mogą znacznie poprawić zdolność tkanek do wykonywania ich funkcji. Jedną z takich metod, coraz częściej stosowanej w sporcie aktywnością fizyczną jest zdalne niedokrwienne warunki wstępne (RIPC). W większości przypadków ta procedura obejmuje powtarzające się krótkie cykle niedokrwienia kończyn i reperfuzji. I często mówi się, że pomaga zwiększyć tolerancję leczonych tkanek do występowania możliwych epizodów niedokrwiennych w przyszłości. Liczne badania wykazały, że RIPC indukuje zmiany, które prowadzą do zwiększonej odporności na niedotlenienie i wielu innych stresorów tkankowych w narządach Numerus, takich jak mózg, serce, wątroba, nerki itp.

Ponadto, w przypadku mięśni szkieletowych, udowodniono, że indukcja okluzji tętniczej w części wybranych kończyn przed wykonywaniem ćwiczeń fizycznych może wpłynąć na jego aktywność poprzez powodowanie poprawy jej funkcji i wydajności, a zatem może skutkować wyników sportowych (wyniki). Ponadto zaobserwowano większą oporność takich włókien na uszkodzenie wywołane przez skurcze mimośrodowe. Mechanizm tej metody nie jest jednak w pełni poznany, a jego charakter może być bardzo złożony i wpływać na tkankę na wiele etapów jej aktywności.

Z drugiej strony, biorąc pod uwagę, że mięsień szkieletowy jest narządem hormonalnym zdolnym do syntezy i uwalniania wielu białek, cytokin i związków o niskiej masie cząsteczkowej, szczególnie podczas aktywności fizycznej, należy założyć, że sporadyczne epizody niedokrwienne mięśni będą doprowadzić do zwiększonego uwalniania czynników, które będą zwiększyć oporność mięśni i innych tkanek do stresu.

Ponadto adaptacja takich włókien i głównie związana z wydzielaniem wielu czynników wpływających na funkcję całego ciała.

Jedną z takich substancji są kinazy białkowe. Są odpowiedzialne za regulację wielu procesów biologicznych, a także za molekularnie ukierunkowaną przeciwnowotworową terapię ze względu na zwiększony poziom jej aktywności w wielu nowotworach. Te enzymy przeprowadzają reakcję fosforylacji określonych cząsteczek. Fosforylacja zwykle zmienia konformację cząsteczek białka, a zatem zmienia jej aktywność i zdolność do wiązania się z innymi białkami lub ruchem cząsteczki w komórce. Większość badań wskazuje, że odgrywają kluczową rolę w wielu podstawowych procesach komórkowych, takich jak cykl komórkowy, podział komórek, różnicowanie i apoptoza. Deregulacja aktywności kinazy w wyniku mutacji chromosomalnych, przegrupowań i / lub amplifikacji genów obserwuje się u wielu rodzajów komórek rakowych. Dlatego takie procedury takie jak RIPC lub intensywna aktywność fizyczna, która może wpływać na jej aktywność, mogą być specyficznymi inhibitorami tych enzymów, spełniając ideę terapii ukierunkowanej molekularnie. Dlatego dochodzimy do wniosku, że może to wpływać na niektóre specyficzne kinazy białkowe (takie jak kinazy N-końcowe C-Jun (JNK) lub kinaza serynowo-treoniny = kinaza białkowa B (AKTS)) i może być związana z życiem komórek rakowych, szczególnie jeśli efekt jest połączony ze sobą (RIPC + Aktywność fizyczna). Dlatego w naszych badaniach pilotażowych oceniliśmy wpływ 10-dniowej procedury RIPC na potencjał przeciwnowotworowy ludzkiej surowicy w odniesieniu do LNCAP linii guza prostaty. Zaobserwowaliśmy wzrost istotności statystycznej potencjału przeciwnowotworowego ludzkiego surowicy, który może być związany z wpływem na szlaki kinazy białkowej. Wymaga to jednak dalszego potwierdzenia i analiz większej populacji osób poddanych procedurę RIPC i aktywności fizycznej. Na podstawie tych badań jest wskazane ocena, czy procedury niedokrwienne wpływają na właściwości przeciwnowotworowe ludzkiej surowicy w sobie, czy też związane jest z wpływem innych czynników, takich jak aktywność fizyczna.

Jednocześnie zauważono, że w warunkach wywołanych naprężeniami mięśniowymi występują zmiany metabolizmu żelaza. Żelazo jest metalem niezbędnym do prawie wszystkich procesów komórkowych, a z drugiej strony może być bardzo toksyczne - stymulując tworzenie reaktywnych form tlenu (RFT). Wiązanie wolnego żelaza przez białko ferrytyny na poziomie komórki prowadzi do jego większej odporności na stresory. W pryzmat powyższych rozważań wyniki naszych wstępnych badań pokazujących, że procedury RIPC kończyny górnej stosowane w przypadku młodych mężczyzn powodują zmiany w metabolizmie żelaza w białych krwinkach. Zaobserwowaliśmy, że RIPC zwiększa geny ferrytyny i poziom białka w WBC. Wykazano, że wzrost poziomu białka ferrytyny H zmniejsza wytwarzanie ROS z puli Iron Iron i zależne od żelaza. Dane te sugerują, że procedura odległego niedokrwiennego wstępnego kondycjonowania indukowane przez adaptacyjne zmiany wiąże się ze zmianami metabolizmu żelaza.

Jednocześnie wraz ze wzrostem zainteresowania metabolizmem żelaza rośnie rola i funkcja białka prekursorowego amyloidu (APP) i hepcydyny. Udowodniono, że APP jest białkiem, które działa z ferroportiną, biorąc w ten sposób udział w eksporcie żelaza z komórki. Ponadto wykazano, że potranslacyjna modyfikacja APP prowadzi do tworzenia amyloidu α (determinuje zmiany pozytywne) i amyloidu β (zmiany ujemne). Wykazano liczne korzystne działanie działania amyloidu w ludzkim ciele (wzrost wrażliwości na insulinę, efekt neurotroficzny, stymulacja synaptogenezy) ma tendencję do poszukiwania metod indukowania jego wydzielania. Ponadto wzrost stężenia SAPPα będzie związany ze spadkiem postaci Membranowej aplikacji.

Ten sam spadek poziomu białka APP doprowadzi do hamowania eksportu żelaza z komórki i wzrostu jego stężenia w komórce. Charakter takich zmian w metabolizmie żelaza należy uznać za adaptację stresu niedokrwiennego, na którym mięsień jest narażony podczas procedury RIPC. Wzrost ferrytyny w komórce prowadzi do zmniejszenia stężenia wolnego żelaza, a tym samym zmniejszenia tworzenia ROS zależnego od żelaza. Ponadto zmniejszenie eksportu żelaza z komórki doprowadzi do zmniejszenia jego stężenia w płynie pozakomórkowym i krwi, co może również zwiększyć tolerancję na stres.

Hepcydyna, indukuje tłumiący wpływ na ferroportin, ograniczając wchłanianie żelaza z przewodu pokarmowego, a także uwolnienie zasobów systemu ciała wewnątrz naczyniowego, w tym wątroby i makrofagów. Stężenie hepcydyny we krwi wzrasta podczas stanu zapalnego. Wydaje się, że głównym celem tego wzrostu jest ograniczenie dostępności żelaza, które w wolnej formie ma działanie prozapalne i może stymulować rozwój patogenów.

Jak dotąd wykazano, że utrzymanie w warunkach niedotlenienia prowadzi do zmniejszenia stężenia hepcydyny, której celem jest zapewnienie odpowiedniej podaży żelaza do rosnącej erytropoezji. Zmiany te są związane ze wzrostem EPO, który stymuluje erytroblasty do wytwarzania ERFE i hamuje biosyntezę hepcydyny. Z kolei koszar jest danymi, czy procedura RIPC indukuje podstawienie w stężeniu hepcydyny, ERFE i EPO. Z kolei nie ma danych, jeśli procedura RIPC indukuje podstawienie w stężeniu hepcydyny. Podobne nie ma danych, w jaki sposób w tej sytuacji procedura postconditioning może wpływać na stężenie hepcydyny i tworzenie amyloidu α.

Witamina D odgrywa kluczową rolę w regulacji wielu procesów fizjologicznych. Jego aktywność przypisuje się głównie aktywnej formie, 1,25 (OH) 2D3, która działa poprzez określony receptor witaminy D (VDR). VDR jest czynnikiem transkrypcyjnym, który reguluje ekspresję około 1000 genów. VDR jest obecny w prawie wszystkich ludzkich tkankach (Wang i wszystko. 2012). Witamina D jest wytwarzana w skórze w odpowiedzi na ekspozycję na ultrafiolet (światło słoneczne). Następnie jest hydroksylowany w pozycjach 25 i 1, aby uzyskać pełną aktywność hormonalną.

Z drugiej strony, witamina D 25-OH [25 (OH) D3] jest dobrym markerem statusu witaminy D. Nerka, mózg, kość, skóra, prostata i białe krwinki mogą przekształcić 25 (OH) D3 w swoją aktywną postać [1,25 (OH) 2D3]. Można przewidzieć, że niskie poziomy w surowicy 25 (OH) D3 ograniczy syntezę postaci aktywnej we wszystkich tych tkankach. Poziomy D3 w surowicy 25 (OH) są głównie określone przez ekspozycję na światło słoneczne i suplementację witaminy D. Ponadto wyższa zawartość tkanki tłuszczowej wiąże się z niższymi poziomami 25 (OH) D3, prawdopodobnie ze względu na jej zdolność do przechowywania witaminy D. Z drugiej strony wyższa aktywność fizyczna wiąże się z lepszym statusem witaminy D, mimo że wielu sportowców jest niedoborem witamin D. Łącznie powyższe obserwacje wskazują, że metabolity witaminy D mają ważne funkcje biologiczne, które są dalekie od całkowitego zrozumienia. Z drugiej strony nadal brakowało wiedzy na temat aktywności mięśni i stężenia witaminy D. Kluczowe odkrycie, które wskazało na rolę mięśni w utrzymaniu statusu witaminy D, było badanie właściwości komórek mięśni in vitro. Stwierdzono, że błona komórkowa zawiera białka megalinę i szuby. Białka te, podobnie jak w komórkach kanalików nerkowych i w wątrobowych komórkach gwiaździstych, przenoszą DBP z płynu pozakomórkowego do cytoplazmy komórkowej.

Białko wiążące witaminę D ma dwa specyficzne miejsca wiązania o wysokim powinowactwie. Jedna jest dla witaminy D, a jej metabolity o najwyższym powinowactwie to 25 (OH) d. Drugie miejsce wiązania jest specyficzne dla nitkowatej aktyny. Powszechnie trzymana teoria postuluje, że miejsce wiążące aktynę funkcjonuje DBP w celu wiązania aktyny, jeśli uwolniona do krwi z uszkodzonych komórek, a zatem chroni przed koagulacją wewnątrznaczyniową. Jednak od ponad 30 lat wiadomo, że DBP zobowiązuje się do aktyny w mięśniach szkieletowych. Niektóre zinnalizowane DBP mogą być związane z aktyną w aktomyozyna, poprzez jej specyficzne miejsce wiążące aktynę, ale znaczna część reszty jest zobowiązana do aktyny rozproszonej w cytoplazmie.

Od tego czasu przeprowadzono wiele innych badań, a mechanizmy witaminy D stają się coraz bardziej jasne. Niemniej jednak, w jaki sposób witamina D wpływa na ćwiczenia, nie zostało dokładnie omówione. Obecnie wiemy, że wydajność mięśni obniża niedobór witaminy D u ćwiczeń. Wyniki te pośrednio pokazują, że witamina D potencjalnie wpływa na wydajność ćwiczeń; Jednak to, czy witamina D zmniejsza uszkodzenie wywołane wysiłkiem, czy stres oksydacyjny spowodowany ćwiczeniami, wymaga potwierdzenia.

Dlatego kluczowe jest zbadanie wpływu ćwiczeń na metabolizm witaminy D. Ćwiczenie stymulują uwalnianie kilkuset białek (miokin) do krążenia z mięśnia szkieletowego, jednocześnie stymulując wyzwolenie bioaktywnych białek (egzerkin) z innych tkanek. Przykładem takiej egzerkiny jest czynnik wzrostu fibroblastów 23, którego stężenie wzrasta po wysiłku. Ta egzerkina jest odpowiedzialna za regulację poziomów fosforanu w osoczu i modyfikuje metabolizm witaminy D poprzez hamowanie tworzenia 1,25 (OH) 2D3 (Shimada il., 2004). Dlatego wydaje się, że ważne jest ocena wpływu stężenia witaminy D na poziom uszkodzenia mięśni po wysiłku oraz związek między jego stężeniem a stężeniem żelaza a indukowanym procesem zapalnym, który występuje po aktywności fizycznej.

Ostatnie lata przyniosły erę bezkomórkowego DNA (CFDNA) jako potencjalnego biomarkera poziomu urazu, który interesuje się wieloma różnymi dyscyplinami biomedycznymi, w tym w dziedzinie fizjologii ćwiczeń. Istnieje coraz więcej badań poszukujących roli cDNA jako potencjalnego znaku charakterystycznego zespołu przetrenowania w: treningu oporowym, biegu maratonu, ciągłej bieżni, ćwiczeń przyrostowych, ćwiczeń wiosłowych, treningu siłowego.

Oprócz cfDNA może być powiązany z adaptacjami funkcji odpornościowej indukowanej przez uciążliwe ćwiczenia. Publikacja z 2017 r. Ujawniła wzrost poziomu cfDNA nawet podczas aerobowego działającego poniżej stanu ustalonego mleczanu w zależności od intensywności i czasu trwania. Zaobserwowano, że stężenia cfDNA osiągnęły szczyt natychmiast po ostrym ćwiczeniu, a około 1h po wysiłku powróciło do poziomów wyjściowych. Ponadto typowe markery uszkodzenia mięśni szkieletowych (białko C-reaktywne, kwas moczowy, kinaza kreatynowa, mioglobina) wykazują opóźnioną kinetykę w porównaniu z odpowiedzią szczytową cfDNA. Wszystko to podkreśla potencjał cfDNA jako biomarkera do obciążenia ćwiczeń zarówno w stanie aerobowym, jak i beztlenowym. Jednak niewiele wysiłku włożono w znalezienie korelacji między CFDNA a stanem żelaza a ćwiczeniami wywołanym procesem zapalnym.

Projekt ten będzie miał wpływ na rozwój obecnego stanu wiedzy o mechanizmach odpowiedzi biochemicznej na metodę wpływającą na określoną tkankę w postaci zdalnego niedokrwiennego wstępnego kondycjonowania i pozwoli na określenie roli czynników troficznych Sappα i Bdnf oraz zmian metabolizmu żelaza w tym procesie. Ponadto obecny projekt może przyczynić się do określenia roli przedstawionych procedur w proliferacji komórek, jako przykład właściwości anty-tumor.

Dlatego wyniki tego projektu mogą być znaczącym krokiem w rozszerzeniu zrozumienia roli niedokrwiennego warunkowego kondycjonowania w zdrowej populacji (w modulowaniu uszkodzenia mięśni po wysiłku, proliferacji komórek, procesie zapalenia) oraz roli metabolizmu żelaza i witaminy D w tych zmianach, wiedza na temat ochronnego działania RIPC i ich związku z Sappatem, BDNF zmian i białej aktywności Kinazu. używać.

Cele projektu badawczego

Projekt ma na celu:

1. Demonstracja, czy zdalne niedokrwienne warunki wstępne (RIPC) wpłynie na stężenie BDNF, hepcydynę i cfDNA;
2. Wskaż, czy i jak długa pojedyncza sesja RIPC wpłynie na stężenie SAPPα, BDNF i hepcydyny oraz czy zmianom tym towarzyszy większa odporność mięśni szkieletowych w celu uszkodzenia wywołanych przez ekscentryczne ćwiczenia;
3. Pokaż, czy szkolenie oparte na 10-dniowym odległym kondycjonowaniu niedokrwiennym spowoduje wyższe zmiany SAPPα, BDNF, hepcydyny erytropheron (ERFE) i erytropoetyny (EPO) (w porównaniu z pojedynczą sesją RIPC);
4. Wskaż, czy krążący bezpłatny DNA (cfDNA) może być stosowany jako nowy biomarker wczesnego stadium uszkodzenia mięśni i treningowy przeciążenie beztlenowe durin.
5. Wskaż, czy pojedynczy i 10-dniowy odległy trening niedokrwienny wpływa na zmiany stężenia metabolitów witaminy D i czy zmiany te zależą od żelaza.
6. Wykazać, czy stężenie białka wiążącego witaminę D (GC-globulinę) zmienia się pod wpływem pojedynczych i 10-dniowych procedur wstępnych niedokrwiennych i jak wpływa na stężenie metabolitów VIT D D.
7. Pokaż, w jaki sposób RIPC i procedury aktywności fizycznej wpływają na potencjał przeciwnowotworowy ludzkiej surowicy i czy jest to związane ze statusem witaminy D i metabolizmem żelaza

Hipotezy:

W projekcie na podstawie aktualnej wiedzy podano następujące hipotezy:

1. Odległe warunki niedokrwienne (RIPC) zwiększy stężenie Sappα i BDNF, które będzie korelować z wyższą odpornością na mięśnie szkieletowe na uszkodzenie;
2. Trening RIPC zwiększy stężenie SAPPα i BDNF, które utrzyma się w dłuższym okresie, który przechodzi do jednej sesji RIPC;
3. Wpływ aktywności fizycznej na białko wiążące witaminę D, megalinę, stężenie stężenia szuby.
4. Procedury RIPC i wysoki status witanu D chronią mięśnie i zmniejsza stres oksydacyjny wywołany ćwiczeniami fizycznymi i chroni przed stresem oksydacyjnym wywołanym przez wysokie stężenie żelaza (niższy proces stanu zapalnego i stężenie cfDNA).
5. Procedury RIPC Wpływ na potencjał przeciwnowotworowy ludzkiej w surowicy przeciwko ludzkim komórek raka prostaty LNCAP.

Plan pracy

Aby osiągnąć cele badania 60 osób, a następnie losowo podzielone na dwie grupy:

• Eksperymentalna - zdalna grupa niedokrwienna wstępna (RIPC),
• Grupa kontrolna (c). Ponadto grupy zostaną podzielone na podgrupy, aby wdrożyć założenia jednorazowego i 10-krotnie wpływu RIPC na poziom wywołanego uszkodzenia mięśni i poziomu maksymalnej pojemności beztlenowej. Całe badanie zostanie przeprowadzone przy użyciu założeń eksperymentu - testu pustego i zgodnie z zasadami eksperymentu krzyżowego.

Plan eksperymentu:

1. Rejestracja uczestników - wszyscy nieprzeszkoleni pacjenci zostaną wybrani na podstawie listu intencyjnego.

2. Pomiary laboratoryjne

   1. Test beztlenowy (test beztlenowy skrzydła), RIPC 1 czas, RIPC 10 razy, test beztlenowy (test beztlenowy skrzydła),
   2. Test aerobowy (protokół Bruce'a), RIPC 1, RIPC 10 razy, test aerobowy (protokół Bruce),
   3. Ocena ludzkiej surowicy (z jednorazowego, dziesięciodniowego treningu RIPC i populacji placebo) potencjał przeciwnowotworowy na ludzkich komórkach raka prostaty LNCAP
   4. Chemia krwi i analiza molekularna
3. Analiza i interpretacja wyników, przygotowanie publikacji naukowych
4. Przygotowanie publikacji naukowych, rozliczenie projektu

Materiał Badanie zostanie wykorzystane celowo wybór zgodnie z kryteriami włączenia badania.

4.2 Procedury

Badanie będzie składać się z sześciu części:

1. ocena ogólnego zdrowia (badanie lekarskie) i zapoznanie się z szczegółowym protokołem badań;
2. Ocena maksymalnej pojemności beztlenowej (Want);
3. Ocena jednorazowego i dziesięciodniowego szkolenia RIPC na poziomie maksymalnej pojemności beztlenowej;
4. Ocena wpływu jednorazowego procedury postc po przetestowaniu, na poziom markerów odpowiedzi zapalnych, homeostazy żelaza, metabolitów VIT D i BDNF, wydzielanie SAPP α w grupach badawczych po 24 godzinach odpoczynku od testowania;
5. Ocena ludzkiej surowicy (od jednorazowego, dziesięciodniowego treningu RIPC i populacji placebo) potencjał przeciwnowotworowy na ludzkich komórkach raka prostaty LNCAP;
6. Ocena wybranych wykładników laboratoryjnych w próbkach w surowicy i w osoczu zebranych podczas badania 24 godziny, 48 godzin, 72 godziny i 120 godzin od epizodu uszkodzenia mięśni wywołanych ćwiczeniami ekscentrycznymi;

Każdy uczestnik będzie w stanie nawodnienia i przed pierwszym posiłkiem w godzinach porannych (8: 00-9: 00 rano). Przed odpowiednimi środkami każdy uczestnicy mieli tydzień wcześniej sesję zapoznawczą ze wszystkimi procedurami.

Procedura niedokrwienna zostanie przeprowadzona przed rozpoczęciem procedur Want i Excentryczne ćwiczenia i uszkodzenia mięśni zgodnie ze szczegółowym opisem procedury RIPC. Czterokrotne wypełnienie kołnierza flotacyjnego zostanie wykonane o 5 minut do wartości 200 mm Hg z 5 minutami odpoczynku w pobliżu przyczepności początkowego prostego mięśnia uda. Wszystkie wykonane procedury zostaną przeprowadzone pod kontrolą Dopplera USG w celu wykonania pełnego ograniczenia przepływu krwi.

4.4 Pomiar mocy beztlenowej kończyn dolnych (test beztlenowy skrzydła) dla beztlenowej mocy kończyny dolnej części beztlenowej (Want) zostanie przeprowadzony na ergometrze cyklu (Monark 894E, szczytowy rower z Szwecji). Dla każdego uczestnika wysokość siodła zostanie indywidualnie dostosowana, aby kąt kolanowy po skoku w dół wynosił około 170-175 °. Przed jakimkolwiek testowaniem eksperymentalnym każda osoba wykonuje 5-minutową rozgrzewkę ergometru cyklu o tempie 60 obr/min i 1 W/kg. Po pięciu minutach przerwy każdy uczestnik zostanie poproszony o pedał z maksymalnym wysiłkiem przez okres 30 s w stosunku do stałego obciążenia rezystancyjnego 75 g/kg całkowitej masy ciała. Każdy uczestnik został poinstruowany tak szybko, jak to możliwe, i otrzymał odliczanie 3S, zanim zastosowano ustacyjny opór werbalny, aby utrzymać najwyższą możliwą kadencję przez cały czas. Dane z ergometru cyklo będą rejestrowane za pośrednictwem komputera za pomocą oprogramowania MCE 5.1.

Zmienne zostaną analizowane jako wartości bezwzględne (W) i w stosunku do masy ciała (w/kg).

4.5 Próbki krwi Zbieranie i pomiary

Metodologia gromadzenia krwi w testach diagnostycznych będzie ściśle zależna od wymagań określonego oznaczenia i będzie zgodna z procedurami badawczymi (ustalonymi na podstawie danych literatury). Do analizy laboratoryjnej zostanie zebrana krew obwodowa. Zgodnie z planem:

• Dla Want: Po raz raz i 10-dniowy RIPC-przed ćwiczeniami fizycznymi (wczesnym rankiem, bez posiłku), natychmiast po zakończeniu testu skrzydła (do 5 minut po testie), po 30 minutach odpoczynku po zakończeniu testu skrzydła (30-35 minut po teście), 60 minut po, 6 godzin po, 24 godziny po tym, jak chce.

Spożycie zostanie wykonane w odpowiednich znormalizowanych probówkach przez wykwalifikowanego personelu medycznego:

Surowica i plazma zostaną oddzielone od próbek. Ogólna ocena stanu homeostazy będzie oparta na wstępnych testach laboratoryjnych. W przypadku jakościowego wykrywania pojedynczych białek zaangażowanych w technikę obrony przeciwutleniającej Western blotting będzie.

W przypadku analizy cfDNA: krew zostanie zebrana do bezkomórkowych rur DNA przed wysiłkiem fizycznym (rano, na pustym żołądku), bezpośrednio po zakończeniu próby, 5 minut i 60 minut po zakończeniu ćwiczeń. Zebrany materiał będzie przechowywany w lodówce lub na lodzie do izolacji CFDNA.

CFDNA zostanie zebrany do bezkomórkowych rur DNA i izolowany za pomocą zestawu szybkiego CFDNA i zestawu plazmowego zgodnie z protokołem producenta. Uzyskany materiał zostanie porcji, przechowywany w -200 ° C, a następnie zastosowany do dalszych analiz.

Wszystkie proponowane procedury immunoenzymatyczne będą przeprowadzane przy użyciu dostępnych i znormalizowanych metod. Większość zostanie oznaczona metodą immunoenzyme (ELISA) lub jednostki multipleksowania systemów Luminex. Test ELISA służy do wykrywania określonych białek w materiale testowym za pomocą przeciwciał sprzężonych enzymów mono lub poliklonalnych. Zostaną użyte gotowe odczynniki ELISA. Stężenie produktu końcowego zostanie ocenione przez pomiar absorpcji i porównania ze standardowym rozwiązaniem. Odczyty zostaną wykonane na czytniku mikropłytkowym ELISA Thermo Scientific Microplate i Magpix Xponent 4.2, Ruo.

Stężenie metabolitów witaminy D zostanie wykonane przy użyciu chromatografii cieczowej w połączeniu z tandemową spektrometrią mas (Qtrap®4500 (SCIEX) SH w połączeniu z systemem EXIONLC HPLC). Próbki surowicy zostaną przeanalizowane w trybie dodatnim jonowym, stosując jonizację elektrorozpylania. Surowe dane zostaną zebrane przy użyciu labsolutions LCGC. Aby przetworzyć i określić ilościowo zebrane dane, zostanie również zastosowane LABSOLUTES LCGC. Poniższy wit. D zostaną określone metabolity: 25 (OH) D3, 24,25 (OH) 2D3, 3-EPI-25 (OH) D3 i 25 (OH) D2; oraz współczynniki 25 (OH) D3 do 24,25 (OH) 2D3 i 25 (OH) D3 do 3-EPI-25 (OH) D3.

Aby określić stężenie SAPPα, konieczne będzie całkowite usunięcie albuminy z ludzkiego osocza. Początkowe wstępne testy wykazały, że liniowość i czułość tej ELISA są nieoptymalne ze względu na niespecyficzne wiązanie przypisane wysokiej zawartości białka w niemodyfikowanym ludzkim osoczu. Dlatego wszystkie próbki osocza muszą być immunosububturowane HSA przed analizą. Poziomy SAPPα ELISA muszą być następnie znormalizowane do całkowitego sygnałów zachodnich SAPP (jednostki względne). Procedura obejmuje wstępną frakcję w surowicy przez wyczerpanie ludzkiej albuminy surowicy za pomocą ludzkiej albuminy proteomelab IGY opartej na kolumnie HSA Spinel (Phenomenex, Torrance, CA). Procedura zostanie potwierdzona przez wstępne zastosowanie metody Western blot w celu określenia zawartości białka w próbkach poddanych oczyszczaniu. Poziomy SAPPα zostaną określone za pomocą metody ELISA - laboratoria immunobiologiczne, gumy, Japonia.

W przypadku wykrywania białek zostanie wykonana technika Western blotting. Próbka ulegnie denaturacji białka, a następnie elektroforezy żelowej. Syntetyczne lub przeciwciało (przeciwciało pierwotne) rozpoznaje i wiąże się z specyficznym białkiem docelowym.

Membranę elektroforezy myje się w roztworze zawierającym pierwotne przeciwciało, zanim nadmiar przeciwciał zostanie zmywany. Dodano wtórne przeciwciało, które rozpoznaje i wiąże się z pierwotnym przeciwciałem. Wtórne przeciwciało wizualizuje się różnymi metodami, takimi jak barwienie, immunofluorescencja i radioaktywność, umożliwiając pośrednie wykrywanie specyficznego białka docelowego.

4.6. Linie komórkowe aktywności cytotoksycznej i warunki hodowli. Linia komórkowa LNCAP będzie hodowana w pożywce RPMI 1640 (GIBCO; Rockville, MD, USA) uzupełniona 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (Culilab, Brazylia), 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, i inkubowano ją w atmosfery sokoi i 5%. Aktywność cytotoksyczna zostanie oceniona: komórki wysiano na 96-studzienkowych mikropłytkach (105 komórek/ml) w RPMI 1640 uzupełnionym 10% FBS w nieobecności lub obecności EEHS (25-200 μg/ml) przez 24 godziny w atmosferze nawilżonej w 37 ° C i 5% CO2. Po tym okresie komórki przemyto PBS i ponownie zawieszono w buforze (0,01 M HEPES, pH = 7,4, 0,14 M NaCl i 2,5 mM CACL2). Zaznaczone komórki będą fluorescencyjnie znakowane i analizowane przy użyciu cytometru przepływowego Accuri C6 i specyficznego oprogramowania.

4.7 Analiza statystyczna Wyniki zostaną przeanalizowane statystycznie przy użyciu oprogramowania StatisticA. Znaczenie statystyczne zostanie określone dla p <0,05. Projekt analizuje istotność różnic w wynikach, parametrach Want i laboratoryjnych między grupami; Istotność zmian po środowisku i analiza regresji wyników testu.

W zależności od rozkładu normalnego (test Shapiro-WILK) zmiennych i spełniający kryteria jednorodności wariancji (test Levene) przeprowadzono test parametryczny lub nieparametryczny. Aby ocenić test statystyczny dla zmiennych markerów biochemicznych, zostanie on przekształcony log2.