Ischämische Vorkonditionierung - Nutzungs Perspektiven Vivio/In -vitro -Studien

Sowohl in Sport als auch in der Medizin werden ständig neue Methoden gesucht, die die Fähigkeit von Geweben erheblich verbessern können, ihre Funktionen auszuführen. Eine dieser Methoden, die zunehmend auch im Sport verwendet wird, ist die remot -ischämische Vorkonditionierung (RIPC). In den meisten Fällen umfasst dieses Verfahren wiederholte kurze Zyklen von Gliedmaßen -Ischämie und Reperfusion. Und oft wird gesagt, dass es hilft, die Toleranz von behandelten Geweben gegenüber dem Auftreten möglicher ischämischer Episoden in der Zukunft zu erhöhen. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass RIPC Veränderungen induziert, die zu einer erhöhten Resistenz gegen Hypoxie und vielen anderen Gewebestressoren in Numerus -Organen wie Gehirn, Herz, Leber, Nieren usw. führen.

Darüber hinaus wurde bei Skelettmuskeln nachgewiesen, dass die Induktion der arteriellen Okklusion in den ausgewählten Gliedmaßen vor Ausführung physischer Übungen ihre Aktivität beeinflussen kann, indem sie die Verbesserung seiner Funktion und Leistung verursacht und somit zu Sportwerken (Ergebnisse) führen kann. Zusätzlich wurde ein größerer Widerstand solcher Fasern gegen durch exzentrische Kontraktionen verursachte Schäden beobachtet. Der Mechanismus dieser Methode ist jedoch nicht vollständig verstanden, und sein Charakter kann sehr komplex sein und wirkt sich auf viele Stadien seiner Aktivität aus.

Andererseits, wenn man bedenkt, dass der Skelettmuskel ein endokrines Organ ist, das zur Synthese fähig ist, und eine Reihe von Proteinen, Zytokinen und Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht freizusetzen, insbesondere während der körperlichen Aktivität, sollte angenommen werden, dass intermittierende Muskel -ischämische Episoden zu einer erhöhten Freisetzung von Faktoren führen, die die Resistenz der Muskeln und andere Tissueses zu belasten.

Darüber hinaus habe ich die Anpassung solcher Fasern hauptsächlich mit der Sekretion vieler Faktoren in Verbindung gebracht, die die gesamte Körperfunktion beeinflussen.

Eine dieser Substanzen sind Proteinkinasen. Sie sind für die Regulierung vieler biologischer Prozesse sowie für eine molekular gezielte Krebstherapie verantwortlich Diese Enzyme führen die Phosphorylierungsreaktion von spezifischen Molekülen durch. Die Phosphorylierung verändert normalerweise die Konformation der Proteinmoleküle und verändert folglich seine Aktivität und die Fähigkeit, an andere Proteine zu binden, oder die Bewegung des Moleküls in der Zelle. Die meisten Untersuchungen zeigen, dass sie in vielen grundlegenden zellulären Prozessen wie dem Zellzyklus, der Zellteilung, der Differenzierung und der Apoptose eine Schlüsselrolle spielen. Die Deregulation der Kinaseaktivität infolge chromosomaler Mutationen, Umlagerungen und / oder Genamplifikation wird in vielen Arten von Krebszellen beobachtet. Daher können solche Verfahren wie RIPC oder intensive körperliche Aktivität, die die Aktivität beeinflussen könnten, spezifische Inhibitoren dieser Enzyme sein, die die Idee der molekular gezielten Therapie erfüllen. Daher schließen wir, dass es einige spezifische Proteinkinasen (wie C-Jun-N-terminale Kinasen (JNKs) oder Serin-Threonin-Kinase = Proteinkinase B (AKTs)) beeinflussen kann und mit der Lebensdauer von Krebszellen verbunden sein kann, insbesondere wenn die Wirkung miteinander kombiniert wird (RIPC + Körperaktivität). Daher haben wir in unseren Pilotstudien die Wirkung des 10-Tage-RIPC-Verfahrens auf das Antitumorpotential des menschlichen Serums in Bezug auf die LNCAP der Prostata-Tumorlinie untersucht. Wir beobachteten die statistische Signifikanzzunahme des menschlichen Serumantitumorpotentials, was mit der Wirkung auf Proteinkinase -Wege verbunden sein kann. Dies erfordert jedoch eine weitere Bestätigung und Analysen einer größeren Population von Menschen, die dem RIPC -Verfahren und körperlichen Aktivität ausgesetzt sind. Aus dieser Forschung scheint es ratsam zu beurteilen, ob die ischämischen Verfahren die Antitumoreigenschaften des menschlichen Serums für sich selbst beeinflussen oder mit den Auswirkungen anderer Faktoren wie körperlicher Aktivität verbunden sind.

Gleichzeitig wurde festgestellt, dass unter Bedingungen muskulärer Stress Veränderungen des Eisenstoffwechsels auftreten. Eisen ist ein Metall, das für fast alle Zellprozesse notwendig ist, und andererseits kann es sehr giftig sein - und die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (RFT) stimulieren. Die Bindung von freiem Eisen durch das Ferritinprotein auf Zellebene führt zu seiner größeren Resistenz gegen Stressoren. Im Prism der obigen Überlegungen führen die Ergebnisse unserer vorläufigen Studien, die zeigen, dass die bei jungen Männern angewendeten RIPC -Verfahren in der oberen Extremität Veränderungen des Eisenstoffwechsels in weißen Blutkörperchen verursachen. Wir beobachteten, dass RIPC die Ferritingene und den Proteinspiegel in WBC erhöht. Es wurde gezeigt, dass eine Zunahme des Ferritin-H-Proteinspiegels labilen Eisenpool und die Eisen-abhängige ROS-Bildung verringert. Diese Daten legen nahe, dass das Verfahren der abgelegenen ischämischen Vorkonditionierung induzierten adaptiven Veränderungen mit Änderungen des Eisenstoffwechsels verbunden ist.

Gleichzeitig nimmt die Rolle und Funktion des Amyloid -Vorläuferproteins (APP) und Hepcidin mit dem zunehmenden Interesse am Eisenstoffwechsel zu. Es wurde nachgewiesen, dass App ein Protein ist, das mit Ferroportin zusammenarbeitet und so an Eisenexport aus einer Zelle teilnimmt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die posttranslationale Modifikation von App zur Bildung von Amyloid α (bestimmt positive Veränderungen) und Amyloid-β (negative Veränderungen) führt. Es wurde zahlreiche vorteilhafte Wirkungen der Wirkung von Amyloid α im menschlichen Körper gezeigt (Anstieg der Insulinempfindlichkeit, neurotropher Wirkung, Stimulation der Synaptogenese) neigen dazu, Methoden zur Induktion seiner Sekretion zu suchen. Darüber hinaus wird eine Zunahme der SAPPα -Konzentration mit einer Abnahme der Membranform der App verbunden sein.

Die gleiche Abnahme des APP -Proteinspiegels führt zur Hemmung des Eisenexports aus der Zelle und zur Zunahme seiner Konzentration in der Zelle. Die Art solcher Veränderungen des Eisenstoffwechsels sollte als adaptiv an den ischämischen Stress angesehen werden, auf den Muskeln während des RIPC -Verfahrens ausgesetzt sind. Der Anstieg des Ferritins in der Zelle führt zu einer Abnahme der Konzentration von freiem Eisen und damit zu einer Verringerung der eisenabhängigen ROS -Bildung. Darüber hinaus führt die Verringerung des Eisenexports aus der Zelle zu einer Abnahme seiner Konzentration in der extrazellulären Flüssigkeit und dem Blut, was auch die Toleranz gegenüber Stress erhöhen kann.

Hepcidin induziert eine unterdrückende Wirkung auf Ferroportin und begrenzt die Absorption von Eisen aus dem Magen-Darm-Trakt sowie deren Freisetzung aus den Ressourcen des intra-menschlichen Körpersystems, einschließlich Leber und Makrophagen. Die Konzentration von Hepcidin im Blut nimmt während der Entzündung zu. Es scheint, dass das Hauptziel dieser Erhöhung darin besteht, die Verfügbarkeit von Eisen zu begrenzen, was in freier Form einen entzündungshemmenden Effekt hat und die Entwicklung von Krankheitserregern stimulieren kann.

Bisher wurde gezeigt, dass der Aufenthalt unter Hypoxiebedingungen zu einer Verringerung der Konzentration von Hepcidin führt, die darauf abzielt, eine angemessene Eisenversorgung an die zunehmende Erythropoese zu gewährleisten. Diese Veränderungen sind mit einer Zunahme des EPO verbunden, die Erythroblasten zur produzierten ERFE stimulieren und die Hepcidin -Biosynthese hemmen. Die Kaserne ist wiederum Daten, ob das RIPC -Verfahren eine Substitution in Hepcidin-, ERFE- und EPO -Konzentration induziert. Im Gegenzug gibt es keine Daten, wenn das RIPC -Verfahren durch die Hepcidin -Konzentration Substitution induziert. Ähnlich gibt es keine Daten, wie sich in dieser Situation die Hepcidinkonzentration und die Bildung von Amyloid α beeinflussen können.

Vitamin D spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulation mehrerer physiologischer Prozesse. Seine Aktivität wird hauptsächlich der aktiven Form 1,25 (OH) 2D3 zugeschrieben, die über einen spezifischen Vitamin -D -Rezeptor (VDR) wirkt. VDR ist ein Transkriptionsfaktor, der die Expression von ungefähr 1000 Genen reguliert. VDR ist in fast allen menschlichen Geweben vorhanden (Wang et al. 2012). Vitamin D wird in der Haut als Reaktion auf ultraviolette (Sonneneinstrahlung) Exposition erzeugt. Anschließend wird es an den Positionen 25 und 1 hydroxyliert, um die volle hormonelle Aktivität zu erhalten.

Andererseits ist 25-oh Vitamin D [25 (OH) D3] ein guter Marker für den Vitamin-D-Status. Die Nieren-, Gehirn-, Knochen-, Haut-, Prostata- und weiße Blutkörperchen können 25 (OH) D3 in seine aktive Form umwandeln [1,25 (OH) 2D3]. Es kann erwartet werden, dass niedrige Serumspiegel von 25 (OH) D3 die Synthese der aktiven Form in all diesen Geweben einschränken. Serum 25 (OH) D3 -Spiegel werden hauptsächlich durch die Supplementierung von Sonnenlicht und Vitamin D bestimmt. Darüber hinaus ist ein höherer Fettgewebegehalt mit einem niedrigeren Serum 25 (OH) D3-Spiegel verbunden, möglicherweise aufgrund seiner Fähigkeit, Vitamin D zu speichern. Andererseits ist eine höhere körperliche Aktivität mit einem besseren Vitamin-D-Status verbunden, obwohl viele Sportler Vitamin D-Mangel sind. Insgesamt zeigen die obigen Beobachtungen, dass Vitamin -D -Metaboliten wichtige biologische Funktionen aufweisen, die weit davon entfernt sind, vollständig verstanden zu werden. Andererseits mangelte es immer noch an Kenntnissen über die Muskelnaktivität und die Vitamin -D -Konzentration. Die wichtigste Entdeckung, die auf eine Rolle für den Muskel bei der Aufrechterhaltung des Vitamin -D -Status hinwies, kam aus der Untersuchung der Eigenschaften von Muskelzellen in vitro. Es wurde festgestellt, dass die Zellmembran die Proteine Megalin und Kubilin enthält. Diese Proteine transportieren wie die in den Nieren -Tubuluszellen und in hepatischen Sternzellen DBP aus der extrazellulären Flüssigkeit in das Zellzytoplasma.

Das Vitamin-D-Bindungsprotein hat zwei spezifische Bindungsstellen mit hoher Affinität. Eine ist für Vitamin D und seine Metaboliten mit der höchsten Affinität für 25 (OH) d. Die andere Bindungsstelle ist spezifisch für filamentöse Aktin. Eine allgemein gehaltene Theorie postuliert, dass die Aktin-bindende Stelle von DBP funktioniert, um Actin zu binden, wenn sie aus beschädigten Zellen in Blut freigesetzt werden, und somit vor intravaskulärer Koagulation schützt. Seit über 30 Jahren ist es jedoch bekannt, dass DBP im Skelettmuskel verpflichtet ist. Einige der internalisierten DBP könnten über seine spezifische Aktin-Bindungsstelle in Actomyosin an Actin verpflichtet werden, aber ein Großteil des Restes ist verpflichtet, Actin im gesamten Zytoplasma dispergiert zu haben.

Seitdem wurden viele weitere Studien durchgeführt, und die Mechanismen von Vitamin D sind zunehmend klarer geworden. Dennoch wurde nicht gründlich diskutiert, wie Vitamin D sich auf das Training auswirkt. Derzeit wissen wir, dass die Muskelleistung den Vitamin -D -Mangel bei Trainingseinheiten senkt. Diese Ergebnisse zeigen indirekt, dass Vitamin D möglicherweise die Trainingsleistung beeinflusst. Unabhängig davon, ob Vitamin D die durch das Training induzierte Schädigung oder den durch Bewegung verursachten oxidativen Stress reduziert, muss jedoch eine Bestätigung erforderlich sind.

Daher ist es wichtig, die Auswirkungen des Trainings auf den Vitamin -D -Metabolismus zu untersuchen. Das Training stimuliert die Freisetzung mehrerer Hundert Proteine (Myokine) in die Zirkulation aus dem Skelettmuskel und stimuliert gleichzeitig die Befreiung bioaktiver Proteine (Exkons) aus anderen Geweben. Ein Beispiel für ein solches Exerkin ist der Fibroblasten -Wachstumsfaktor 23, dessen Konzentration nach dem Training zunimmt. Dieses Exerkin ist für die Regulation der Plasma -Phosphatspiegel verantwortlich und modifiziert den Vitamin -D -Metabolismus, indem die Bildung von 1,25 (OH) 2D3 hemmt (Shimada et al., 2004). Daher erscheint es wichtig, die Auswirkung der Vitamin-D-Konzentration auf das Niveau der Muskelschädigung nach dem Training und die Beziehung zwischen seiner Konzentration und der Eisenkonzentration und dem induzierten entzündlichen Prozess, der nach körperlicher Aktivität auftritt, zu bewerten.

Die letzten Jahre brachten die Ära der zellfreien DNA (CFDNA) als potenzieller Biomarker für den Verletzungsniveau, was an vielen verschiedenen biomedizinischen Disziplinen, einschließlich des Bereichs der Übungsphysiologie, interessiert ist. Es gibt immer mehr Studien, die nach der Rolle von cDNA als potenzielles Kennzeichen des Übertraining -Syndroms in: Widerstandstraining, Marathonlauf, kontinuierliches Laufband, inkrementelle Übungen, Ruderübung, Krafttraining.

Neben CFDNA kann es mit der durch anstrengenden Bewegung induzierten Immunfunktion in Verbindung gebracht werden oder die Anpassungen der Immunfunktion auslösen. Die Veröffentlichung aus dem Jahr 2017 ergab einen Anstieg des CFDNA -Spiegels, selbst während der aeroben Laktat -Steady -Zustand in Abhängigkeit von Intensität und Dauer. Es wurde beobachtet, dass die CFDNA-Konzentrationen unmittelbar nach akuter Bewegung ihren Höhepunkt erreichten und etwa 1 Stunde nach dem Training zu den Grundlinienniveaus zurückkehrte. Darüber hinaus zeigen typische Marker für die Schädigung des Skelettmuskels (C-reaktives Protein, Harnsäure, Kreatinkinase, Myoglobin) eine verzögerte Kinetik im Vergleich zur CFDNA-Peakreaktion. All dies unterstreicht das Potenzial von CFDNA als Biomarker für die Übungsbelastung sowohl in der aerobischen als auch im anaeroben Zustand. Es gab jedoch nicht viel Aufwand, die Korrelationen zwischen CFDNA und Eisenzustand und durch Übungen induzierten Entzündungsprozess zu finden.

Dieses Projekt wird einen Einfluss auf die Entwicklung des aktuellen Wissens des Wissens über die Mechanismen der biochemischen Reaktion auf bestimmte Gewebe haben, die die Methode in Form einer abgelegenen ischämischen Vorkonditionierung beeinflussen und die Rolle von SAPPα- und BDNF -Trophäenfaktoren sowie Veränderungen des Eisenstoffwechsels in diesem Prozess unter Berücksichtigung der Rolle von Hepcidin- und Vitamin -D. -D. -D. d. - Darüber hinaus kann das vorliegende Projekt zur Bestimmung der Rolle der vorgestellten Verfahren zur Zellproliferation als Beispiel für Antität-Tumor-Eigentümer beitragen.

Daher könnten die Ergebnisse dieses Projekts ein signifikanter Schritt zur Erweiterung des Verständnisses der Rolle der ischämischen Vorkonditionierung in der gesunden Population (bei der Modulation des Muskelschadens nach dem Training, der Proliferation von Zellen, dem Entzündungsprozess) und der Rolle des Eisenstoffwechsels und der Vitamin-D-Veränderung.

Forschungsprojektziele

Das Projekt zielt darauf ab:

1. Demonstration, ob eine abgelegene ischämische Vorkonditionierung (RIPC) die BDNF-, Hepcidin- und CFDNA -Konzentration beeinflusst;
2. Geben Sie an, ob und wie lange einzelne RIPC -Sitzung die Konzentration von SAPPα-, BDNF- und Hepcidin -Konzentration beeinflussen wird und ob diese Veränderungen mit einer stärkeren Resistenz der Skelettmuskulatur zu schädigenden Schäden begleitet werden, die durch exzentrische Übungen induziert werden.
3. Zeigen Sie, ob ein Training auf der Grundlage einer 10-tägigen ischämischen Vorkonditionierung zu höheren Veränderungen von SAPPα-, BDNF-, Hepcidin EryTropheron (ERFE )- und Erythropoietin (EPO) -Konzentration (im Vergleich zu einer einzigen RIPC-Sitzung) induziert wird.
4. Geben Sie an, ob zirkulierende freie DNA (CFDNA) als neuer Biomarker im Frühstadium für Muskelschäden und Trainingsüberlastungs-Durin-anaerobe Aktivität verwendet werden kann.
5. Geben Sie an, ob ein und 10-tägiges, ischämisches Vorkonditionierungstraining die Konzentration der Vitamin-D-Metaboliten beeinflusst und ob diese Veränderungen eisenabhängig sind.
6. Zeigen, ob sich die Vitamin-D-Bindungsproteinkonzentration (GC-Globulin) unter Einfluss von Einzel- und 10-tägigen Fern-Ischämie-Vorkonditionierungsverfahren verändert und wie es die Vit-D-Metabolitenkonzentration beeinflusst.
7. Zeigen Sie, wie RIPC- und körperliche Aktivitätsverfahren das menschliche Serum-Antitumorpotential beeinflussen, und ist mit dem Vitamin-D-Status und dem Eisenstoffwechsel verbunden

Hypothesen:

Im Projekt auf der Grundlage des aktuellen Wissens werden die folgenden Hypothesen angegeben:

1. Fern -ischämische Vorkonditionierung (RIPC) erhöht die Konzentration von SAPPα und BDNF, die mit einer höheren Skelettmuskelresistenz gegen Schäden korrelieren.
2. Das RIPC -Training erhöht die Konzentration von SAPPα und BDNF, die über einen längeren Zeitraum bestehen, der zu einer einzigen RIPC -Sitzung zusammenfasst.
3. Körperliche Aktivitätseffekte auf Vitamin D -Bindungsprotein, Megalin, Kubilinkonzentration ändert sich.
4. RIPC -Verfahren und ein hoher Vit -D -Status schützen die Muskeln und reduzieren oxidativen Stress, der durch körperliches Training induziert wird, und schützt vor oxidativem Stress, das durch hohe Eisenkonzentration induziert wird (niedrigerer Entzündungsprozess und CFDNA -Konzentration).
5. RIPC-Verfahren wirken sich auf das menschliche Serum-Antitumorpotential gegen menschliche LNCAP-Prostatakrebszellen aus.

Arbeitsplan

Um die Ziele der Studie zu erreichen, werden 60 Personen rekrutiert und dann zufällig in zwei Gruppen unterteilt:

• Experimentelle - REPC (Remote Ischämische Voraussetzungsgruppe), RIPC,
• Kontrollgruppe (c). Darüber hinaus werden die Gruppen in Untergruppen unterteilt, um die Annahmen der einmaligen und 10-maligen RIPC-Auswirkungen auf den Niveau eines induzierten Muskelschadens und des Grades der maximalen anaeroben Kapazität zu implementieren. Die gesamte Studie wird unter Verwendung der Annahmen des Experiments durchgeführt - ein Blankentest und gemäß den Prinzipien des Kreuzverfruchtungsexperiments.

Experimentplan:

1. Einschreibung der Teilnehmer - Alle untrainierten Probanden werden auf der Grundlage des Absichtsschreibens ausgewählt.

2. Labormessungen

   1. Anaerobe Test (Wingate Anaerobe Test), RIPC 1 Mal, RIPC 10 Mal, anaerobe Test (Wingate Anaerobe Test),
   2. Aerobic Test (Bruce Protocol), RIPC 1 Zeit, RIPC 10 Mal, aerobe Test (Bruce Protocol),
   3. Bewertung des menschlichen Serums (aus einmaligen, zehntägigen RIPC-Training und Placebo-Populationen) Antitumorpotential auf menschlichem LNCAP-Prostatakrebszellen
   4. Blutchemie und molekulare Analyse
3. Analyse und Interpretation von Ergebnissen, Erstellung wissenschaftlicher Veröffentlichungen
4. Vorbereitung wissenschaftlicher Veröffentlichungen, Projektabrechnung

Material Die Studie wird nach den Kriterien für die Studie einbezogen.

4.2 Verfahren

Die Studie besteht aus sechs Teilen:

1. Bewertung der allgemeinen Gesundheit (medizinische Untersuchung) und Einberufung mit einem detaillierten Studienprotokoll;
2. Bewertung der maximalen anaeroben Kapazität (Wünsche);
3. Bewertung eines einmaligen und zehntägigen RIPC-Trainings auf dem Niveau der maximalen anaeroben Kapazität;
4. Bewertung der Auswirkungen des einmaligen Postc-Verfahrens nach der Wünsche Tests auf dem Niveau der Entzündungsantwortmarker, der Eisenhomöostase, der Vit-D-Metaboliten und der BDNF, der SAPP-α-Sekretion in Forschungsgruppen nach 24-stündiger Ruhe aus dem Wünschen Tests;
5. Bewertung des menschlichen Serums (aus einmaligem, zehntägigem RIPC-Training und Placebo-Populationen) Antitumorpotential an menschlichen LNCAP-Prostatakrebszellen;
6. Bewertung ausgewählter Laborponenten in Serum- und Plasmaproben, die während der Studie 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden und 120 Stunden aus einer durch exzentrischen Übungen verursachten Muskelschäden gesammelt wurden;

Jeder Teilnehmer ist im hydratisierten Zustand und vor seiner ersten Mahlzeit in den Morgenstunden (8: 00-9: 00 Uhr). Vor ordnungsgemäßen Maßnahmen hatte jeder Teilnehmer eine Woche früher eine Einarbeitungssitzung mit allen Verfahren.

Das ischämische Verfahren wird vor Beginn der Wünsche und exzentrischen Übungsverfahren und Muskelschäden gemäß der detaillierten Beschreibung des RIPC -Verfahrens durchgeführt. Die vierfache Füllung des Flotationsflansches wird um 5 Minuten bis zum Wert von 200 mm Hg mit 5 Minuten Ruheintervall in der Nähe der Befestigung des anfänglichen Oberschenkelmuskels durchgeführt. Alle durchgeführten Verfahren werden unter der USG -Kontrolle der Doppler durchgeführt, um die volle arterielle Blutflussrestriktion durchzuführen.

4.4 Messung der anaeroben Leistung der unteren Gliedmaßen (Wingate Anaerobe Test) für die anaerobe Leistung der unteren Gliedmaßen Messung des anaeroben Tests (Mangel) wird auf einem Zyklus -Ergometer durchgeführt (Monark 894e, Peakbike aus Schweden). Für jeden Teilnehmer wird die Sattelhöhe einzeln eingestellt, sodass der nach dem Abwärtshub-Kniewinkel ungefähr 170-175 ° beträgt. Vor experimenteller Tests führt jede Person ein 5-minütiges Aufwärmen auf dem Zyklus-Ergometer mit Tempo von 60 U/min und 1W/kg durch. Nach fünf Minuten Pause wird jeder Teilnehmer gebeten, mit maximaler Aufwand für einen Zeitraum von 30 s gegen eine feste Widerstandsbelastung von 75 g/kg Gesamtkörpermasse zu treten. Jeder Teilnehmer wurde angewiesen, so schnell wie möglich zu fahren, und erhielt einen 3S -Countdown, bevor der festgelegte Widerstand angewendet wurde. Die mündliche Ermutigung wird allen Teilnehmern ermutigt, seine höchstmögliche Trittfrequenz durch die Wünsche aufrechtzuerhalten. Daten aus dem Cyclo -Ergometer werden über Computer mit der MCE 5.1 -Software aufgezeichnet.

Variablen werden als Absolutwerte (W) und relativ zur Körpermasse (W/kg) analysiert.

4.5 Blutproben Sammlung und Messungen

Die Methodik der Blutsammlung für diagnostische Tests hängt streng von den Anforderungen einer bestimmten Bezeichnung ab und entspricht den Forschungsverfahren (auf der Grundlage von Literaturdaten). Für die Laboranalyse wird peripheres Blut gesammelt. gemäß dem Plan:

• Für Mangel: Für einmal und 10 Tage RIPC-vor körperlicher Bewegung (am frühen Morgen ohne Mahlzeit) unmittelbar nach Abschluss des Wingate-Test

Die Aufnahme wird in geeigneten standardisierten Röhren durch qualifiziertes medizinisches Personal durchgeführt:

Serum und Plasma werden von den Proben getrennt. Die allgemeine Bewertung des Homoeostase -Staates wird auf vorläufigen Labortests beruhen. Für den qualitativen Nachweis einzelner Proteine, die an der Antioxidationsverteidigung beteiligt sind, werden Western Blotting -Technik durchgeführt.

Für die CFDNA-Analyse: Blut wird vor körperlicher Bewegung (am Morgen auf leeren Magen) unmittelbar nach dem Ende des Versuchs in zellfreie DNA-Röhrchen gesammelt, 5 Minuten und 60 Minuten nach dem Ende des Trainings. Das gesammelte Material wird zur CFDNA -Isolation in einem Kühlschrank oder auf Eis gelagert.

CFDNA wird in zellfreie DNA-Röhrchen gesammelt und unter Verwendung von Quick-CFDNA-Serum- und Plasma-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Das erhaltene Material wird aliquotiert, in -200c gespeichert und anschließend für weitere Analysen verwendet.

Alle vorgeschlagenen immunzymatischen Verfahren werden mit verfügbaren und standardisierten Methoden durchgeführt. Die meisten werden mit der Immunoenzym -Methode (ELISA) oder der Multiplexing -Einheit von Luminex -Systemen bezeichnet. Der ELISA -Test wird verwendet, um spezifische Proteine im Testmaterial unter Verwendung von mono- oder polyklonalen konjugierten Enzymantikörpern nachzuweisen. Es werden ELISA-Kits mit vorgefertigten Reagenzien verwendet. Die Konzentration des Endprodukts wird durch Messung der Absorption und im Vergleich mit der Standardlösung bewertet. Die Messwerte werden auf dem ELISA Thermo Scientific Microplate Reader und Magpix Xponent 4.2 System, Ruo, vorgenommen.

Die Konzentration der Vitamin -D -Metaboliten wird unter Verwendung von Flüssigchromatographie mit Tandemmassenspektrometrie (QTRAP®4500 (SCIEX) SHOUPLED mit ExionLC -HPLC -System) durchgeführt. Serumproben werden im positiven Ionenmodus unter Verwendung der Elektrospray -Ionisierung analysiert. Die Rohdaten werden mit Labsolutions LCGC gesammelt. Um die gesammelten Daten zu verarbeiten und zu quantifizieren, wird auch Labsolutions LCGC verwendet. Der folgende Vit. D Metaboliten werden bestimmt: 25 (OH) D3, 24,25 (OH) 2D3, 3-EPI-25 (OH) D3 und 25 (OH) D2-Spiegel; und die Verhältnisse von 25 (OH) D3 zu 24,25 (OH) 2D3 und 25 (OH) D3 bis 3-EPI-25 (OH) D3.

Um die SAPPα -Konzentration zu bestimmen, muss Albumin aus menschlichem Plasma vollständig entfernt werden. Erste vorläufige Tests zeigten, dass die Linearität und Empfindlichkeit dieser ELISA aufgrund der nicht spezifischen Bindung suboptimal ist, die auf den hohen Proteingehalt des nicht modifizierten menschlichen Plasma zurückzuführen ist. Daher müssen alle Plasmaproben vor der Analyse HSA-Immunosubraction sein. Die SAPPα -ELISA -Spiegel müssen dann auf Gesamt -Sapp -westliche Signale (relative Einheiten) normalisiert werden. Die Prozedur umfasst eine Serumvoranschlag, indem das menschliche Serumalbumin mithilfe menschlicher Proteomelab-Igy-Albumin auf einer HSA-Spinelläule (Phenomenex, Torrance, CA) abgebaut wird. Das Verfahren wird durch die vorläufige Anwendung der Western -Blot -Methode bestätigt, um den Proteingehalt in den von der Reinigung unterzogenen Proben zu bestimmen. Die SAPPα -Spiegel werden unter Verwendung der ELISA -Methode - immunobiologische Labors, Gummi, Japan - bestimmt.

Für die Protein -qualitative Nachweis wird eine Western -Blot -Technik durchgeführt. Die Probe wird einer Proteindenaturierung unterzogen, gefolgt von Gelelektrophorese. Ein synthetischer oder Antikörper (primärer Antikörper) erkennt und bindet an ein spezifisches Zielprotein.

Die Elektrophorese -Membran wird in einer Lösung gewaschen, die den primären Antikörper enthält, bevor überschüssiger Antikörper abgewaschen wird. Ein sekundärer Antikörper wird zugesetzt, der den primären Antikörper erkennt und an bindet. Der sekundäre Antikörper wird durch verschiedene Methoden wie Färbung, Immunfluoreszenz und Radioaktivität visualisiert, wodurch der indirekte Nachweis des spezifischen Zielproteins ermöglicht wird.

4.6. Zytotoxische Aktivitätszelllinien und Kulturbedingungen. Die LNCAP -Zelllinie wird in RPMI 1640 -Medium (Gibco; Rockville, MD, USA) kultiviert, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Cultilab, Brasilien), 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Strptomycin und 5% und 5%, und wurde in einer 37 -° -K -C -C -Mose in einer 37 -° -K -C -Mose in 37 ° C und in einer 37 -° -K -CO2 in einer 37 ° C -CO 2. Die zytotoxische Aktivität wird bewertet: Die Zellen wurden auf 96-Well-Mikroplatten (105 Zellen/ml) in RPMI 1640 mit 10% FBS in Abwesenheit oder Anwesenheit der EEHS (25-200 μg/ml) für 24 H in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 ° C und 5% CO2, plattiert. Nach diesem Zeitraum wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in Puffer resuspendiert (0,01 M Hepes, pH = 7,4, 0,14 m NaCl und 2,5 mM CACL2). Die gefärbten Zellen werden mit einem Accuri C6 -Durchflusszytometer und einer spezifischen Software fluoreszenz markiert und analysiert.

4.7 Statistische Analyse Die Ergebnisse werden statistisch unter Verwendung der Statistica -Software analysiert. Die statistische Signifikanz wird für p <0,05 bestimmt. Das Projekt analysiert die Signifikanz von Unterschieden in Ergebnis-, Mangel- und Laborparametern zwischen den Gruppen. Signifikanz von Veränderungen nach Mangel und Regressionsanalyse von Testergebnissen.

Abhängig von der Normalverteilung (Shapiro-Wilk-Test) der Variablen und der Erfüllung der Kriterien der Homogenität von Varianzen (Levene-Test) wird der parametrische oder nicht parametrische Test durchgeführt. Um den statistischen Test für die Faltenweiche der biochemischen Marker zu bewerten, wird er log2 transformiert.