Ischemické předkondicionování - Perspektivy použití vivio/in vitro

Ve sportu i medicíně se neustále vyhledávají nové metody, které mohou výrazně zlepšit schopnost tkání plnit své funkce. Jednou z takových metod, která se stále více používá ve sportu, je fyzická aktivita je ischemická předkondicionování (RIPC). Ve většině případů tento postup zahrnuje opakované krátké cykly ischemie končetin a reperfuze. A často se říká, že to pomáhá zvyšovat toleranci ošetřených tkání na výskyt možných ischemických epizod v budoucnosti. Četné studie ukázaly, že RIPC indukuje změny, které vedou ke zvýšené rezistenci na hypoxii a mnoho dalších tkáňových stresorů v orgánech Numerus, jako je mozek, srdce, játra, ledviny atd.

Kromě toho v případě kosterních svalů bylo prokázáno, že indukce arteriální okluze v části vybraných končetin před provedením fyzického cvičení může ovlivnit jeho aktivitu tím, že způsobí zlepšení její funkce a výkonu, a proto může vést ke sportovnímu skóre (výsledky). Kromě toho byla pozorována větší odolnost takových vláken k poškození vyvolané excentrickými kontrakcemi. Mechanismus této metody však není plně pochopen a jeho charakter může být velmi složitý a ovlivňuje tkáň na mnoha stádiích její aktivity.

Na druhé straně vzhledem k tomu, že kosterní sval je endokrinní orgán schopný syntézu a uvolňování řady proteinů, cytokinů a nízké molekulové hmotnosti, zejména během fyzické aktivity, by se mělo předpokládat, že přerušované svalové ischemické epizody povede ke zvýšení faktorů, které zvýší rezistenci svalů a jiné tkáně na stres.

Kromě toho, adaptace takových vláken jsem většinou spojoval s sekrecí mnoha faktorů, které ovlivňují funkci celého těla.

Jednou z takových látek jsou proteinové kinázy. Jsou zodpovědné za regulaci mnoha biologických procesů a za molekulárně cílenou protirakovinovou terapii v důsledku zvýšené úrovně, kterou je to aktivita u mnoha rakovin. Tyto enzymy provádějí fosforylační reakci specifických molekul. Fosforylace obvykle mění konformaci molekul proteinů a následně mění její aktivitu a schopnost vázat se na jiné proteiny nebo pohyb molekuly v buňce. Většina výzkumu ukazuje, že hrají klíčovou roli v mnoha základních buněčných procesech, jako je buněčný cyklus, dělení buněk, diferenciace a apoptóza. U mnoha typů rakovinných buněk je pozorována deregulace kinázové aktivity v důsledku chromozomálních mutací, přeskupení a / nebo amplifikace genu. Proto takové postupy, jako je RIPC nebo intenzivní fyzická aktivita, která by mohla ovlivnit její aktivitu, mohou být specifickými inhibitory těchto enzymů, což splňuje myšlenku molekulárně cílené terapie. Proto jsme dospěli k závěru, že může ovlivnit některé specifické proteinové kinázy (jako jsou C-Jun N-terminální kinázy (JNK) nebo serin-threonin kináza = protein kináza B (AKT)) a může být spojena s životností rakovinných buněk, zejména pokud je účinek kombinován společně (RIPC + fyzikální aktivita). Proto jsme v našich pilotních studiích posoudili účinek 10denního postupu RIPC na protinádorový potenciál lidského séra ve vztahu k LNCAP nádorové linie prostaty. Pozorovali jsme zvýšení statistické významnosti protinádorového potenciálu lidského séra, který může být spojen s vlivem na dráhy proteinové kinázy. To však vyžaduje další potvrzení a analýzy větší populace lidí podrobených postupu RIPC a fyzické aktivitě. Z tohoto výzkumu se zdá být vhodné posoudit, zda ischemické postupy ovlivňují protinádorové vlastnosti lidského séra samy o sobě, nebo je spojeno s dopadem dalších faktorů, jako je fyzická aktivita.

Současně bylo zaznamenáno, že za podmínek svalového stresu vyvolané změny v metabolismu železa dochází. Železo je kov, který je nezbytný pro téměř všechny buněčné procesy a na druhé straně to může být velmi toxické - stimuluje tvorbu reaktivních druhů kyslíku (RFT). Vazba volného železa prostřednictvím proteinu feritinu na úrovni buněk vede k jeho větší odolnosti vůči stresorům. V hranolu výše uvedených úvah výsledky našich předběžných studií ukazují, že postupy RIPC horní končetiny použité v případě mladých mužů způsobují změny metabolismu železa v bílých krvinek. Zjistili jsme, že RIPC zvyšuje ferritinové geny a hladinu proteinu ve WBC. Bylo prokázáno, že zvýšení hladiny proteinu Ferritinu H snižuje tvorbu ROS závislého na labile a železo. Tato data naznačují, že postup vzdáleného ischemického předkondicionování vyvolaného adaptivního změny je spojen se změnami metabolismu železa.

Současně se zvyšuje rostoucí zájem o metabolismus železa a funkce amyloidního prekurzorového proteinu (APP) a hepcidinu roste. Bylo prokázáno, že aplikace je protein, který pracuje s ferroportinem, a tak se účastní vývozu železa z buňky. Navíc se ukázalo, že posttranslační modifikace APP vede k tvorbě amyloidu a (určuje pozitivní změny) a amyloidní β (negativní změny). Bylo prokázáno, že četné příznivé účinky působení amyloidu a v lidském těle (zvýšení citlivosti na inzulín, neurotrofický účinek, stimulace synaptogeneze) mají tendenci hledat metody pro indukci jeho sekrece. Kromě toho bude zvýšení koncentrace SAPPa spojeno se snížením membránové formy aplikace.

Stejné snížení hladiny proteinu APP povede k inhibici vývozu železa z buňky a ke zvýšení jeho koncentrace v buňce. Povaha takových změn v metabolismu železa by měla být považována za adaptivní k ischemickému stresu, na kterém je sval vystaven během postupu RIPC. Zvýšení ferritinu v buňce vede ke snížení koncentrace volného železa a tedy ke snížení tvorby ROS závislé na železe. Kromě toho snížení vývozu železa z buňky povede ke snížení jeho koncentrace v extracelulární tekutině a krvi, což může také zvýšit toleranci ke stresu.

Hepcidin indukuje potlačující účinek na ferroportin a omezuje absorpci železa z gastrointestinálního traktu a jeho uvolňování ze zdrojů intra-lidského těla, včetně jater a makrofágů. Koncentrace hepcidinu v krvi se během zánětu zvyšuje. Zdá se, že hlavním cílem tohoto zvýšení je omezit dostupnost železa, která má ve volné formě prozánětlivý účinek a může stimulovat vývoj patogenů.

Doposud bylo prokázáno, že pobyt za podmínek hypoxie vede ke snížení koncentrace hepcidinu, jehož cílem je zajistit odpovídající dodávku železa do rostoucí erytropoézy. Tyto změny jsou spojeny se zvýšením EPO, které budou stimulovat erytroblasty k produkci ERFE a bude inhibovat biosyntézu hepcidinu. Kárista je zase data, zda postup RIPC vyvolá substituci v koncentraci hepcidinu, Erfe a EPO. Na oplátku neexistují žádná data, pokud postup RIPC vyvolá substituci při koncentraci hepcidinu. Podobné neexistují žádná data, jak v této situaci může postupu postkondicionování ovlivnit koncentraci hepcidinu a tvorbu amyloidu α.

Vitamin D hraje klíčovou roli v regulaci více fyziologických procesů. Jeho aktivita je připisována hlavně aktivní formě, 1,25 (OH) 2d3, která působí prostřednictvím specifického receptoru vitamínu D (VDR). VDR je transkripční faktor, který reguluje expresi přibližně 1000 genů. VDR je přítomen téměř ve všech lidských tkáních (Wang et. 2012). Vitamin D se produkuje v kůži v reakci na expozici ultrafialu (sluneční světlo). Následně je hydroxylován v pozicích 25 a 1, aby získal plnou hormonální aktivitu.

Na druhé straně je vitamin D [25 (OH) D3] 25-OH dobrým markerem stavu vitamínu D. Ledvina, mozek, kosti, kůže, prostaty a bílé krvinky mohou převést 25 (OH) D3 na jeho aktivní formu [1,25 (OH) 2d3]. Lze očekávat, že nízké hladiny séra 25 (OH) D3 omezí syntézu aktivní formy ve všech těchto tkáních. Hladiny séra 25 (OH) D3 jsou stanoveny hlavně expozicí sundovaci slunečního světla a vitamínu D. Kromě toho je vyšší obsah tukové tkáně spojen s nižšími hladinami D3 séra 25 (OH) D3, pravděpodobně kvůli jeho schopnosti ukládat vitamín D. Na druhé straně je vyšší fyzická aktivita spojena s lepším stavem vitamínu D, i když mnoho sportovců je vitamin D-deficientní. Souhrnně výše uvedená pozorování naznačují, že metabolity vitamínu D mají důležité biologické funkce, které zdaleka nejsou zcela pochopeny. Na druhé straně stále chyběl znalosti o aktivitě svalů a koncentraci vitamínu D. Klíčový objev, který poukázal na roli svalu při udržování stavu vitamínu D, pocházel ze studia vlastností svalových buněk in vitro. Bylo zjištěno, že buněčná membrána obsahuje proteiny megalin a kubilinu. Tyto proteiny, stejně jako proteiny v buňkách renálních tubulů a v jaterních hvězdných buňkách, transportují DBP z extracelulární tekutiny do cytoplazmy buněk.

Protein vázající vitamín D má dvě specifická vazebná místa s vysokou afinitou. Jeden je pro vitamín D a jeho metabolity s nejvyšší afinitou pro 25 (OH) d. Druhé vazebné místo je specifické pro vláknitý aktin. Obecně držená teorie předpokládá, že místo vazebné a aktinové funkce DBP funguje, aby se vázala aktin, pokud je uvolněno do krve z poškozených buněk, a proto chrání před intravaskulární koagulací. Přesto je známo více než 30 let, že se DBP stane navázáno na kosterní svaly. Některé z internalizovaných DBP by mohly být navázány na aktin v actomyosinu prostřednictvím svého specifického místa vázajícího se na aktin, ale většina zbytku je povinen k aktinu dispergované v cytoplazmě.

Od té doby bylo provedeno mnoho dalších studií a mechanismy vitamínu D jsou stále jasnější. Nicméně o tom, jak vitamin D ovlivňuje cvičení, nebylo důkladně diskutováno. V současné době víme, že výkon svalů snižuje nedostatek vitamínu D u cvičebních. Tyto výsledky nepřímo ukazují, že vitamin D potenciálně ovlivňuje výkon cvičení; Zda však vitamin D snižuje poškození vyvolané cvičením nebo oxidační stres způsobený cvičením vyžaduje potvrzení.

Proto je zásadní studovat účinky cvičení na metabolismus vitamínu D. Cvičení stimuluje uvolňování několika stovek proteinů (myokinů) do oběhu z kosterního svalu a zároveň stimuluje osvobození bioaktivních proteinů (exerkines) z jiných tkání. Příkladem takového exerkinu je fibroblastový růstový faktor 23, jehož koncentrace se po cvičení zvyšuje. Tento exerkin je zodpovědný za regulaci hladin plazmatického fosfátu a modifikuje metabolismus vitamínu D inhibicí tvorby 1,25 (OH) 2d3 (Shimada et., 2004). Zdá se proto důležité posoudit účinek koncentrace vitamínu D na úroveň poškození svalu po cvičení a vztah mezi jeho koncentrací a koncentrací železa a indukovaným zánětlivým procesem, ke kterému dochází po fyzické aktivitě.

V posledních letech přinesla éru bez buněk DNA (CFDNA) jako potenciální biomarker úrovně zranění, která získává zájem o mnoho různých biomedicínských disciplín, včetně oblasti fyziologie cvičení. Stále více a více studií, které hledají roli cDNA jako potenciálního znaku syndromu přetrénování v: trénink rezistence, maratónský běh, kontinuální běh běžícího pásu, přírůstkové cvičení, veslování, silový trénink.

Kromě CFDNA může souviset nebo může být spojeno nebo spustit adaptace imunitní funkce vyvolané namáhavým cvičením. Publikace z roku 2017 odhalila zvýšení hladiny CFDNA i během aerobního běhu pod ustáleným stavem laktátu v závislosti na intenzitě a trvání. Bylo pozorováno, že koncentrace CFDNA dosáhly vrcholu okamžitě po akutním cvičení a asi 1 h po cvičení se vrátily na základní hladinu. Kromě toho typické markery poškození kosterního svalstva (C-reaktivní protein, kyselina močová, kreatinová kináza, myoglobin) vykazují zpožděnou kinetiku ve srovnání s pík CFDNA. To vše zdůrazňuje potenciál cfDNA jako biomarkeru pro cvičební zatížení v aerobním i anaerobním stavu. Nebylo však mnoho úsilí vynaloženo na nalezení korelací mezi CFDNA a železným stavem a cvičeními vyvolaný proces zánětu.

Tento projekt bude mít dopad na vývoj současného stavu znalostí mechanismů biochemické reakce na specifickou tkáň ovlivňující metodu ve formě vzdáleného ischemického předkondicionování a umožní určit roli Trofických faktorů SAPPa a BDNF a změny v metabolismu železa v tomto procesu v úvahu roli hepcidinu a vitaminu D. Současný projekt může navíc přispívat k určení úlohy prezentovaných postupů na proliferaci buněk, jako příklad vlastností antytumorů.

Therefore, the results of this project could be a significant step in expanding understanding of the role of ischemic preconditioning in the healthy population (in modulating post-exercise muscle damage, cells proliferation, inflammation process) and the role of iron metabolism and vitamin D in those changes In addition, the knowledge on the protective effect of RIPC procedures and their relation to sAPPα, BDNF changes and protein kinase activity will give overview of its novel activity a používat.

Cíle výzkumného projektu

Cílem projektu je:

1. Demonstrace, zda vzdálené ischemické předkondicionování (RIPC) ovlivní koncentraci BDNF, hepcidinu a cfDNA;
2. Uveďte, zda a jak dlouhá jediná relace RIPC ovlivní koncentraci SAPPa, BDNF a hepcidinu a zda budou tyto změny doprovázeny větší odolností kosterních svalů k poškození vyvolané excentrickými cvičeními;
3. Ukažte, zda trénink založený na 10denním odlehlém ischemickém předkondicionování vyvolá vyšší změny koncentrace SAPPa, BDNF, hepcidinu erytroferonu (ERFE) a erytropoetin (EPO) (ve srovnání s jedinou RIPC relací);
4. Uveďte, zda může být cirkulující volná DNA (CFDNA) použita jako nový biomarker v rané fázi poškození svalů a přetížení tréninku Anaerobní aktivita.
5. Uveďte, zda jednodenní a 10denní vzdálený trénink ischemického předkondicionování ovlivňuje změny koncentrace metabolitů vitamínu D a zda jsou tyto změny závislé na železe.
6. Prokazujte, zda koncentrace proteinu vázajícího vitamin D (GC-globulin) mění při vlivu jednotlivých a desetidenních postupů ischemického předkondicionování a jak ovlivňuje koncentraci metabolitů vit D.
7. Ukažte, jak postupy RIPC a fyzické aktivity ovlivňují potenciál protinádoru lidského séra a je spojen se stavem vitamínu D a metabolismem železa

Hypotézy:

V projektu na základě současných znalostí jsou uvedeny následující hypotézy:

1. Vzdálené ischemické předkondicionování (RIPC) zvýší koncentraci SAPPa a BDNF, což bude korelovat s vyšší odolností proti kosternímu svalu vůči poškození;
2. Trénink RIPC zvýší koncentraci SAPPa a BDNF, což bude přetrvávat po delší dobu, jak se přibližuje do jedné relace RIPC;
3. Účinky fyzické aktivity na protein vázající vitamin D, změny koncentrace megalinu, koncentrace kubilinu.
4. Postupy RIPC a vysoký stav Vit D chrání svaly a snižují oxidační stres vyvolaný fyzickým cvičením a chrání před oxidačním stresem vyvolaným vysokou koncentrací železa (nižší proces zánětu a koncentrací CFDNA).
5. Postupy RIPC ovlivňují lidský sérový protinádorový potenciál proti lidským buňkám rakoviny prostaty LNCAP.

Pracovní plán

Za účelem dosažení cílů studie bude přijato 60 lidí, poté náhodně rozděleni do dvou skupin:

• Experimentální - vzdálená ischemická skupina předběžných předpovědí (RIPC),
• Kontrolní skupina (C). Kromě toho budou skupiny rozděleny do podskupin, aby se implementovaly předpoklady jednorázového a desetinásobného dopadu RIPC na úroveň poškození indukovaného svalu a hladinu maximální anaerobní kapacity. Celá studie bude prováděna pomocí předpokladů experimentu - prázdný test a v souladu se zásadami experimentu s křížovým oplodněním.

Plán experimentu:

1. Zápis účastníků - všechny netrénované subjekty budou vybrány na základě záměru.

2. Laboratorní měření

   1. Anaerobní test (Wingate Anaerobic Test), RIPC 1 čas, RIPC 10krát, anaerobní test (Wingate Anaerobic Test),
   2. Aerobní test (protokol Bruce), RIPC 1 čas, RIPC 10krát, aerobní test (Bruce Protocol),
   3. Hodnocení lidského séra (z jednorázového, desetidenního tréninku RIPC a populací placeba) protinádorový potenciál na lidských buňkách LNCAP prostaty rakoviny prostaty
   4. Chemie krve a molekulární analýza
3. Analýza a interpretace výsledků, příprava vědeckých publikací
4. Příprava vědeckých publikací, vypořádání projektů

Materiál Studie bude použita účelný výběr podle kritérií pro zařazení studie.

4.2 Postupy

Studie bude sestávat ze šesti částí:

1. Hodnocení obecného zdraví (lékařské vyšetření) a seznámení s podrobným protokolem studie;
2. posouzení maximální anaerobní kapacity (WANT);
3. Vyhodnocení jednorázového a desetidenního tréninku RIPC na úrovni maximální anaerobní kapacity;
4. Vyhodnocení dopadu jednorázového postupu Postc po testování chtějí na úroveň zánětlivých markerů odezvy, homeostázy železa, metabolitů Vit D a BDNF, sekrece SAPP a ve výzkumných skupinách po 24hodinovém odpočinku od testování;
5. Hodnocení lidského séra (z jednorázového, desetidenního tréninku RIPC a populace placeba) protinádorového potenciálu na lidských buňkách rakoviny prostaty LNCAP;
6. Vyhodnocení vybraných laboratorních exponentů ve vzorcích séra a plazmy odebraných během studie 24 hodin, 48 hodin, 72 hodin a 120 hodin z epizody poškození svalů vyvolané excentrickými cvičeními;

Každý účastník bude v hydratovaném stavu a před prvním jídlem v ranních hodinách (8: 00-9: 00 hodin). Před správnými opatřeními měli každý účastníci o týden dříve seznámení se všemi postupy.

Ischemický postup bude prováděn před zahájením postupů CHAND a výstřední cvičení a poškození svalů v souladu s podrobným popisem postupu RIPC. Čtyřnásobné plnění flotační příruby bude provedeno 5 minut na hodnotu 200 mm Hg s 5 minutovým intervalem odpočinku poblíž připojení počátečního přímého stehenního svalu. Všechny provedené postupy budou prováděny pod kontrolou Doppleru USG, aby se provedla plné omezení arteriálního krve.

4.4 Měření anaerobní síly dolních končetin (Wingate Anaerobic Test) pro anaerobní sílu měření dolních končetin Wingate Anaerobní test (WANT) bude prováděno na cyklu ergometru (Monark 894E, špičkové kolo ze Švédska). Pro každého účastníka bude výška sedla individuálně upravena tak, aby úhel kolenního kolen dolů je přibližně 170-175 °. Před jakýmkoli experimentálním testováním provede každý jednotlivec 5minutový zahřívání na cyklu ergometru s tempem 60 ot/min a 1W/kg. Po pěti minutách přestávky bude každý účastník požádán, aby šlapal s maximálním úsilím po dobu 30 s proti pevnému odporu 75 g/kg celkové tělesné hmotnosti. Každý účastník byl instruován pokyn, aby cykloval co nejrychleji a dostal odpočítávání 3S před použitím nastaveného odporu, bude všem účastníkům poskytnut slovní povzbuzení, aby si udrželi svou nejvyšší možnou kadenci v celém touze. Data z Ergometru Cyclo bude zaznamenána prostřednictvím počítače se softwarem MCE 5.1.

Proměnné budou analyzovány jako absolutní hodnoty (W) a vzhledem k tělesné hmotnosti (W/kg).

4.5 Sběr a měření vzorků krve

Metodika sběru krve pro diagnostické testy bude přísně závislá na požadavcích konkrétního označení a dodržovat výzkumné postupy (stanovené na základě údajů o literatuře). Pro laboratorní analýzu bude shromážděna periferní krev. v souladu s plánem:

• Pro nedostatky: Najednou a 10denní RIPC-před fyzickým cvičením (brzy ráno, bez jídla), bezprostředně po dokončení testu Wingate (až 5 minut po testu), po 30 minutách odpočinku po dokončení testu Wingate (30-35 minut po testu), 60 minut po 6. hodině poté, 24 hodin po, 24 hodin poté, 24 hodin poté, 24 hodin poté, 24 hodin po, 24 hodin po 24 hodinách po 24 hodinách po 24 hodinách po 24 hodinách poté

Příjem bude prováděn ve vhodných standardizovaných trubicích kvalifikovaným zdravotnickým personálem:

Sérum a plazma budou odděleny od vzorků. Obecné posouzení státu homeostasis bude založeno na předběžných laboratorních testech. Pro kvalitativní detekci jednotlivých proteinů zapojených do techniky antioxidační obrany Western blotting.

Pro analýzu CFDNA: Krev bude shromážděna do trubic bez buněk před fyzickým cvičením (ráno, na lačný žaludek), bezprostředně po skončení pokusu, 5 minut a 60 minut po skončení cvičení. Shromážděný materiál bude uložen v lednici nebo na ledu pro izolaci cfDNA.

CFDNA bude shromažďována do zkumavek bez buněk a izolována pomocí sady rychlé cfDNA séra a plazmy podle protokolu výrobce. Získaný materiál bude alikvotován, uložen v -200 ° C a následně použit pro další analýzy.

Všechny navrhované imunoenzymatické postupy budou prováděny pomocí dostupných a standardizovaných metod. Většina bude určena metodou imunoenzymu (ELISA) nebo luminexová multiplexní jednotka. Test ELISA se používá k detekci specifických proteinů v testovacím materiálu pomocí mono nebo polyklonálních konjugovaných enzymových protilátek. Budou použity připravené reagenční sady ELISA. Koncentrace konečného produktu bude hodnocena měřením absorpce a porovnáním se standardním roztokem. Odečty budou provedeny na systému čtečky mikrodestiček ELISA Thermo Scientific Microdeplate a System Magpix Xponent 4.2, RUO.

Koncentrace metabolitů vitaminu D bude prováděna pomocí kapalinové chromatografie spojené s tandemovou hmotnostní spektrometrií (QTRAP®4500 (SCIEX) SH spojenou se systémem ExionLC HPLC). Vzorky séra budou analyzovány v pozitivním iontovém režimu pomocí elektrosprejové ionizace. Nezpracovaná data budou shromažďována pomocí LCGC LabSolutions. Pro zpracování a kvantifikaci shromážděných dat bude také použita LabSolutions LCGC. Následující Vit. D metabolity budou stanoveny: 25 (OH) D3, 24,25 (OH) 2d3, 3-EPI-25 (OH) D3 a 25 (OH) D2; a poměry 25 (OH) D3 až 24,25 (OH) 2d3 a 25 (OH) D3 až 3-EPI-25 (OH) D3.

Za účelem stanovení koncentrace SAPPa bude nutné zcela odstranit albumin z lidské plazmy. Počáteční předběžné testy odhalily, že linearita a citlivost této ELISA je suboptimální kvůli nespecifické vazbě připisované vysokému obsahu bílkovin v nemodifikované lidské plazmě. Proto musí být všechny vzorky v plazmě HSA-imunosubtraci před analýzou. Hladiny ELISA SAPPa musí být poté normalizovány na celkové signály SAPP Western (relativní jednotky). Postup zahrnuje pre-frakce séra vyčerpáním lidského sérového albuminu s použitím lidského proteomelab igy albuminu založeného na sloupci HSA spinel (Fenomenex, Torrance, CA). Postup bude potvrzen předběžnou aplikací metody Western blot pro stanovení obsahu proteinu ve vzorcích podrobených čištění. Hladiny SAPPa budou stanoveny metodou ELISA - Imunobiologické laboratoře, guma, Japonsko.

Pro kvalitativní detekci proteinu bude provedena technika Western blotting. Vzorek podstoupí denaturace proteinů, následuje gelová elektroforéza. Syntetická nebo protilátka (primární protilátka) rozpozná a váže se na specifický cílový protein.

Elektroforézní membrána se promyje v roztoku obsahujícím primární protilátku, než se přebytečná protilátka promyje. Přidá se sekundární protilátka, která rozpoznává a váže se na primární protilátku. Sekundární protilátka je vizualizována různými metodami, jako je barvení, imunofluorescence a radioaktivita, což umožňuje nepřímou detekci specifického cílového proteinu.

4.6. Cytotoxická aktivita buněčné linie a kultivační podmínky. Buněčná linie LNCAP bude kultivována v RPMI 1640 médiu (Gibco; Rockville, MD, USA) doplněné 10% fetálním hovězím sérem (FBS) (Cultilab, Brazílie), 100 U/ml penicilinu a 100 μg/ml streptomycinu a ve vlhkované atmosféře a 5% CO2. Cytotoxická aktivita bude vyhodnocena: buňky byly naneseny na 96-jamkové mikrodestičky (105 buněk/ml) v RPMI 1640 doplněné 10% FBS v nepřítomnosti nebo přítomnosti EEH (25-200 μg/ml) po dobu 24 hodin ve zvlhčené atmosféře a 5% CO2. Po tomto období byly buňky promyty PBS a resuspendovány v pufru (0,01 M HEPES, pH = 7,4, 0,14 M NaCl a 2,5 mM CaCl2). Obarvené buňky budou fluorescenčně označeny a analyzovány pomocí průtokového cytometru Accuri C6 a specifického softwaru.

4.7 Statistická analýza Výsledky budou analyzovány statisticky pomocí statistického softwaru. Statistická významnost bude stanovena pro p <0,05. Projekt analyzuje význam rozdílů ve výsledcích, přání a laboratorních parametrech mezi skupinami; Význam změn po nedostatku a regresní analýze výsledků testu.

V závislosti na normální distribuci (Shapiro-Wilk test) proměnných a splnění kritérií homogenity variací (Leveneův test) bude proveden parametrický nebo neparametrický test. Pro vyhodnocení statistického testu pro změny násobků biochemických markerů bude log2 transformován.