Precondizionamento ischemico - Prospettive di utilizzo Vivio/in vitro Studi

Sia nello sport che nella medicina, sono in fase di ricerca di costante nuovi nuovi metodi che possono migliorare significativamente la capacità dei tessuti di svolgere le loro funzioni. Uno di tali metodi, sempre più utilizzato anche nello sport un'attività fisica è il precondizionamento ischemico remoto (RIPC). Nella maggior parte dei casi, questa procedura prevede ripetute brevi cicli di ischemia e riperfusione degli arti. E spesso si dice che aiuta ad aumentare la tolleranza dei tessuti trattati con il verificarsi di possibili episodi ischemici in futuro. Numerosi studi hanno dimostrato che RIPC induce cambiamenti che portano ad una maggiore resistenza all'ipossia e a molti altri fattori di stress tissutali negli organi numeri, come cervello, cuore, fegato, reni ecc.

Inoltre, in caso di muscoli scheletrici, è stato dimostrato che l'induzione dell'occlusione arteriosa nella parte degli arti selezionati prima di eseguire esercizi fisici può influire sulla sua attività causando il miglioramento della sua funzione e prestazioni e quindi può comportare punteggi sportivi (risultati). Inoltre, è stata osservata una maggiore resistenza di tali fibre al danno indotto da contrazioni eccentriche. Il meccanismo di questo metodo, tuttavia, non è completamente compreso e il suo carattere può essere molto complesso ed effettua il tessuto su molte fasi della sua attività.

D'altra parte, considerando che il muscolo scheletrico è un organo endocrino in grado di sintesi e rilasciare una serie di proteine, citochine e composti a basso peso molecolare, specialmente durante l'attività fisica, si dovrebbe presumere che gli episodi ischemici del muscolo intermittente porteranno a un aumento del rilascio di fattori che aumenteranno la resistenza dei muscoli e di altri tispi allo stress.

Inoltre, l'adattamento di tali fibre ho associato principalmente alla secrezione di molti fattori che influenzano la funzione del corpo intero.

Una di queste sostanze sono le proteine chinasi. Sono responsabili della regolazione di molti processi biologici, nonché di una terapia anticancro mirata molecolare a causa dell'aumento del livello della sua attività in molti tumori. Questi enzimi eseguono la reazione di fosforilazione di una specifica molecole. La fosforilazione di solito cambia la conformazione delle molecole proteiche e, di conseguenza, cambia l'attività e la capacità di legarsi ad altre proteine o il movimento della molecola all'interno della cellula. La maggior parte delle ricerche indica che svolgono un ruolo chiave in molti processi cellulari fondamentali come il ciclo cellulare, la divisione cellulare, la differenziazione e l'apoptosi. La deregolamentazione dell'attività della chinasi a seguito di mutazioni cromosomiche, riarrangiamenti e / o amplificazione genica in molti tipi di cellule tumorali. Pertanto, tali procedure come RIPC o intensa attività fisica che potrebbero influire sulla sua attività possono essere inibitori specifici di questi enzimi, soddisfacendo l'idea di terapia mirata molecolare. Pertanto, concludiamo che può influenzare alcune specifiche chinasi proteiche (come le chinasi N-terminale C-Jun (JNK) o serina-treonina chinasi = proteina chinasi B (AKTS)) e possono essere associate alla vita delle cellule tumorali, specialmente se l'effetto viene combinato insieme (Attività fisica RIPC +). Pertanto, nei nostri studi pilota, abbiamo valutato l'effetto della procedura RIPC di 10 giorni sul potenziale antitumorale del siero umano in relazione alla linea del tumore della prostata LNCAP. Abbiamo osservato un aumento del significato statistico del potenziale antitumorale sierico umano che può essere collegato all'effetto sulle vie della proteina chinasi. Tuttavia, ciò richiede un'ulteriore conferma e analisi di una popolazione più ampia di persone sottoposte alla procedura RIPC e all'attività fisica. Da questa ricerca sembra consigliabile valutare se le procedure ischemiche influiscono sulle proprietà antitumorali del siero umano da solo o è connessa all'impatto di altri fattori come l'attività fisica.

Allo stesso tempo, si è notato che in condizioni di stress muscolare ha indotto cambiamenti nel metabolismo del ferro. Il ferro è un metallo necessario per quasi tutti i processi cellulari e, d'altra parte, può essere molto tossico: stimolare la formazione di specie reattive di ossigeno (RFT). Il legame del ferro libero attraverso la proteina della ferritina a livello di cellule porta alla sua maggiore resistenza ai fattori di stress. Nel prisma delle considerazioni di cui sopra, i risultati dei nostri studi preliminari che dimostrano che le procedure RIPC dell'arto superiore utilizzate in caso di giovani causano cambiamenti nel metabolismo del ferro nei globuli bianchi. Abbiamo osservato che RIPC aumenta i geni della ferritina e il livello di proteina nel WBC. È stato dimostrato che un aumento del livello di proteina della ferritina H riduce la piscina di ferro labile e la formazione di ROS dipendenti dal ferro. Questi dati suggeriscono che la procedura del precondizionamento ischemico remoto indotto cambiamenti adattivi è associata a cambiamenti nel metabolismo del ferro.

Allo stesso tempo, con il crescente interesse per il metabolismo del ferro il ruolo e la funzione della proteina precursore amiloide (APP) e l'epcidina sta aumentando. È stato dimostrato che l'app è una proteina che funziona con la ferroportina, prendendo così parte all'esportazione di ferro da una cellula. Inoltre, è stato dimostrato che la modifica post-traduzionale dell'app porta alla formazione di amiloide α (determina i cambiamenti positivi) e β amiloide (cambiamenti negativi). Sono stati dimostrati numerosi effetti benefici dell'azione dell'α amiloide nel corpo umano (aumento della sensibilità all'insulina, effetto neurotrofico, stimolazione della sinaptogenesi) tendono a cercare metodi per indurre la sua secrezione. Inoltre, un aumento della concentrazione di SAPPα sarà associato a una diminuzione della forma di APP della membrana.

La stessa diminuzione del livello di proteina APP porterà all'inibizione dell'esportazione di ferro dalla cellula e all'aumento della sua concentrazione nella cellula. La natura di tali cambiamenti nel metabolismo del ferro dovrebbe essere considerata adattativa allo stress ischemico su cui viene esposto il muscolo durante la procedura RIPC. L'aumento della ferritina nella cellula porta a una diminuzione della concentrazione di ferro libero e quindi una riduzione della formazione di ROS dipendente dal ferro. Inoltre, la riduzione dell'esportazione di ferro dalla cellula porterà a una diminuzione della sua concentrazione nel fluido e nel sangue extracellulare, che può anche aumentare la tolleranza allo stress.

L'epcidina, induce un effetto soppressivo sulla ferroportina, limitando l'assorbimento del ferro dal tratto gastrointestinale e il suo rilascio dalle risorse del sistema corporeo intra-umano, tra cui fegato e macrofagi. La concentrazione di epcidina nel sangue aumenta durante l'infiammazione. Sembra che l'obiettivo principale di questo aumento sia limitare la disponibilità di ferro, che nella forma libera ha un effetto pro-infiammatorio e può stimolare lo sviluppo di agenti patogeni.

Finora è stato dimostrato che rimanere in condizioni di ipossia porta a una diminuzione della concentrazione di epcidina, che mira a garantire un'adeguata offerta di ferro alla crescente eritropoiesi. Questi cambiamenti sono associati all'aumento dell'EPO che stimolerà gli eritroblasti al prodotto ERFE e inibirà la biosintesi dell'epcidina. A sua volta, la caserma è dati se la procedura RIPC inducerà la sostituzione nella concentrazione di epcidina, ERFE e EPO. A sua volta, non ci sono dati se la procedura RIPC inducerà la sostituzione alla concentrazione di epcidina. Simile non ci sono dati su come in questa situazione la procedura di postcondizionamento può influire sulla concentrazione di epcidina e la formazione di α amiloide.

La vitamina D svolge un ruolo cruciale nella regolazione di più processi fisiologici. La sua attività è principalmente attribuita alla forma attiva, 1,25 (OH) 2D3, che agisce attraverso un recettore di vitamina D specifico (VDR). VDR è un fattore trascrizionale che regola l'espressione di circa 1000 geni. VDR è presente in quasi tutti i tessuti umani (Wang et a tutti. 2012). La vitamina D è prodotta nella pelle in risposta all'esposizione ultravioletta (luce solare). Successivamente, è idrossilato alle posizioni 25 e 1 per ottenere una piena attività ormonale.

D'altra parte, la vitamina D [25 (OH) D3] 25-OH è un buon marcatore dello stato di vitamina D. I reni, il cervello, l'osso, la pelle, la prostata e i globuli bianchi possono convertire 25 (OH) D3 nella sua forma attiva [1,25 (OH) 2D3]. Si può prevedere che bassi livelli sierici di 25 (OH) D3 limiteranno la sintesi della forma attiva in tutti questi tessuti. I livelli di siero 25 (OH) D3 sono determinati principalmente dall'esposizione alla luce solare e all'integrazione di vitamina D. Inoltre, un maggiore contenuto di tessuto adiposo è associato a livelli sierici di 25 (OH) d3 più bassi, probabilmente a causa della sua capacità di immagazzinare vitamina D. D'altra parte, una maggiore attività fisica è associata a un migliore stato di vitamina D, anche se molti atleti sono con deficit di vitamina D. Collettivamente, le osservazioni di cui sopra indicano che i metaboliti della vitamina D hanno importanti funzioni biologiche, che sono lungi dall'essere completamente comprese. D'altra parte, mancava ancora l'attività dei muscoli e la concentrazione di vitamina D. La scoperta chiave che ha indicato un ruolo per i muscoli nel mantenimento dello stato di vitamina D è derivata dallo studio delle proprietà delle cellule muscolari in vitro. È stato scoperto che la membrana cellulare contiene le proteine megalin e cubilina. Queste proteine, come quelle nelle cellule di tubuli renali e nelle cellule stellate epatiche, trasportano DBP dal fluido extracellulare nel citoplasma cellulare.

La proteina legante la vitamina D ha due siti di legame ad alta affinità specifici. Uno è per la vitamina D e i suoi metaboliti con la massima affinità per 25 (OH) D. L'altro sito vincolante è specifico per l'actina filamentosa. Una teoria comunemente detenuta postula che il sito legante l'actina di DBP funziona per legare l'actina se rilasciato nel sangue dalle cellule danneggiate e, quindi, protegge dalla coagulazione intravascolare. Eppure è noto da oltre 30 anni che DBP diventa legato all'actina nel muscolo scheletrico. Alcuni dei DBP interiorizzati potrebbero essere legati all'actina nell'actomiosina, attraverso il suo specifico sito di legame all'actina, ma gran parte del resto è legato all'actina dispersa in tutto il citoplasma.

Da allora sono stati condotti molti altri studi e i meccanismi di vitamina D sono diventati sempre più chiari. Tuttavia, il modo in cui la vitamina D influisce sull'esercizio fisico non è stato discusso a fondo. Attualmente sappiamo che le prestazioni muscolari riducono la carenza di vitamina D negli esercizi. Questi risultati dimostrano indirettamente che la vitamina D influenza potenzialmente le prestazioni dell'esercizio; Tuttavia, se la vitamina D riduce il danno indotto dall'esercizio o lo stress ossidativo causato dall'esercizio fisico richiede conferma.

Pertanto, è fondamentale studiare gli effetti dell'esercizio sul metabolismo della vitamina D. L'esercizio fisico stimola il rilascio di diverse centinaia di proteine (miochine) nella circolazione dal muscolo scheletrico, stimolando al contempo la liberazione delle proteine bioattive (exerkine) da altri tessuti. Un esempio di tale Exerkine è il fattore di crescita dei fibroblasti 23, la cui concentrazione aumenta dopo l'esercizio. Questo Exerkine è responsabile della regolazione dei livelli plasmatici di fosfato e modifica il metabolismo della vitamina D inibendo la formazione di 1,25 (OH) 2D3 (Shimada et, 2004). Pertanto, sembra importante valutare l'effetto della concentrazione di vitamina D sul livello di danno muscolare post-esercizio e la relazione tra la sua concentrazione e concentrazione di ferro e il processo infiammatorio indotto che si verifica dopo l'attività fisica.

Negli ultimi anni hanno portato l'era del DNA privo di cellule (CFDNA) come potenziale biomarcatore del livello di lesione, che sta acquisendo interesse per molte varie discipline biomediche, incluso il campo della fisiologia dell'esercizio. Ci sono sempre più studi che cercano il ruolo del cDNA come potenziale segno distintivo della sindrome da sovrallenamento: allenamento di resistenza, corsa alla maratona, corsa a tapis roulant, esercizio incrementale, esercizio di canottaggio, allenamento della forza.

Oltre al cfDNA potrebbe essere correlato o innescare adattamenti della funzione immunitaria indotta da un intenso esercizio fisico. La pubblicazione del 2017 ha rivelato un aumento del livello di CFDNA anche durante la corsa aerobica al di sotto dello stato stazionario del lattato a seconda dell'intensità e della durata. È stato osservato che le concentrazioni di cfDNA hanno raggiunto il picco immediatamente dopo l'esercizio acuto e circa 1 ora post-esercizio sono tornati ai livelli di base. Inoltre, i marcatori tipici del danno muscolare scheletrico (proteina C-reattiva, acido urico, creatina chinasi, mioglobina) mostrano una cinetica ritardata rispetto alla risposta al picco del cfDNA. Tutto ciò sottolinea il potenziale del CFDNA come biomarcatore per il carico di esercizio sia in aerobico che nello stato anaerobico. Tuttavia non ci sono stati molti sforzi nel trovare le correlazioni tra cfDNA e stato di ferro e esercizi indotti dal processo di infiammazione.

Questo progetto avrà un impatto sullo sviluppo dello stato attuale della conoscenza dei meccanismi di risposta biochimica al metodo specifico che influisce sui tessuti nella forma di un precondizionamento ischemico remoto e consentirà di determinare il ruolo di SAPPα e BDNF fattori trofici e cambiamenti nel metabolismo del ferro in questo processo, tenendo conto del ruolo di epcidina e di vitamina D. Inoltre, l'attuale progetto può contribuire alla determinazione del ruolo delle procedure presentate sulla proliferazione delle cellule, come esempio di proprietà di anty-tumor.

Pertanto, i risultati di questo progetto potrebbero essere un passo significativo nell'espansione della comprensione del ruolo del precondizionamento ischemico nella popolazione sana (nel modulare il danno muscolare post-esercizio, la proliferazione delle cellule, il processo di infiammazione) e il ruolo del metabolismo del ferro e la vitamina D in superazioni in più, le conoscenze in materia di utilizzo.

Obiettivi del progetto di ricerca

Il progetto mira a:

1. Dimostrazione se il precondizionamento ischemico remoto (RIPC) influenzerà la concentrazione di BDNF, epcidina e cfDNA;
2. Indicare se e per quanto tempo la sessione RIPC singola influenzerà la concentrazione di SAPPα, BDNF ed epcidina e se questi cambiamenti saranno accompagnati da una maggiore resistenza dei muscoli scheletrici ai danni indotti da esercizi eccentrici;
3. Mostra se l'addestramento basato su un precondizionamento ischemico remoto di 10 giorni inducerà una maggiore variazione di SAPPα, BDNF, epcidin erytropheron (ERFE) e eritropoietina (EPO) (rispetto a una singola sessione RIPC);
4. Indicare se il DNA libero circolante (CFDNA) può essere usato come nuovo biomarcatore stadio iniziale di danni muscolari e di allenamento sovraccarico di attività anaerobica.
5. Indicare se l'allenamento di precondizionamento ischemico remoto a singolo e 10 giorni influisce sui cambiamenti di concentrazione dei metaboliti di vitamina D e se tali cambiamenti dipendono dal ferro.
6. Dimostrare se la concentrazione di proteina di legame alla vitamina D (GC-globulina) cambia sotto l'influenza delle procedure di precondizionamento ischemico remota a 10 giorni e di come influisce sulla concentrazione dei metaboliti VIT D.
7. Mostra come le procedure RIPC e di attività fisica influiscono sul potenziale anti-tumore sierico umano ed è associato allo stato di vitamina D e al metabolismo del ferro

Ipotesi:

Nel progetto sulla base delle conoscenze attuali, sono indicate le seguenti ipotesi:

1. Il precondizionamento ischemico remoto (RIPC) aumenterà la concentrazione di SAPPα e BDNF, che si correggerà con una maggiore resistenza ai muscoli scheletrici al danno;
2. L'allenamento RIPC aumenterà la concentrazione di SAPPα e BDNF, che persisterà per un periodo più lungo che compara a una singola sessione RIPC;
3. Effetti di attività fisica sulla proteina legante la vitamina D, megalina, variazioni di concentrazione di cubilina.
4. Le procedure RIPC e lo stato di Vit D elevato proteggono i muscoli e riducono lo stress ossidativo indotto dall'esercizio fisico e protegge dallo stress ossidativo indotto da un'elevata concentrazione di ferro (minore processo di infiammazione e concentrazione di cfDNA).
5. Le procedure RIPC influenzano il potenziale antitumorale sierico umano contro le cellule tumorali della prostata LNCAP umana.

Piano di lavoro

Al fine di raggiungere gli obiettivi dello studio, verranno reclutate 60 persone, quindi divise casualmente in due gruppi:

• Sperimentale - gruppo preconscondibile ischemico remoto (RIPC),
• Gruppo di controllo (c). Inoltre, i gruppi saranno divisi in sottogruppi per attuare le ipotesi di impatto RIPC una tantum e 10 volte sul livello di un danno muscolare indotto e il livello di massima capacità anaerobica. L'intero studio verrà condotto utilizzando le ipotesi dell'esperimento: un test vuoto e in accordo con i principi dell'esperimento cross -fertilizzazione.

Piano di esperimento:

1. Iscrizione dei partecipanti: tutti i soggetti non allenati saranno selezionati sulla base della lettera di intenti.

2. Misurazioni di laboratorio

   1. Test anaerobico (test anaerobico Wingate), RIPC 1 TEMP, RIPC 10 volte, test anaerobico (test anaerobico Wingate),
   2. Test aerobico (Bruce Protocol), RIPC 1 Time, RIPC 10 volte, test aerobico (Bruce Protocol),
   3. Valutazione del siero umano (da una tantum, allenamento RIPC di dieci giorni e popolazioni placebo) potenziale antitumorale sulle cellule tumorali della prostata LNCAP umana
   4. Chimica del sangue e analisi molecolare
3. Analisi e interpretazione dei risultati, preparazione di pubblicazioni scientifiche
4. Preparazione di pubblicazioni scientifiche, insediamento del progetto

Materiale Lo studio verrà utilizzato una selezione intenzionale in base ai criteri di inclusione dello studio.

4.2 Procedure

Lo studio consisterà in sei parti:

1. valutazione della salute generale (esame medico) e familiarizzazione con protocollo di studio dettagliato;
2. valutazione della massima capacità anaerobica (desiderio);
3. Valutazione della formazione RIPC una tantum e dieci giorni a livello di massima capacità anaerobica;
4. Valutazione dell'impatto della procedura PostC una tantum dopo i test di desiderio, a livello di marcatori di risposta infiammatoria, omeostasi di ferro, metaboliti VIT D e BDNF, secrezione di SAPP α in gruppi di ricerca dopo riposo 24 ore di test dai test;
5. Valutazione del siero umano (da una tantum, allenamento RIPC di dieci giorni e popolazioni di placebo) potenziale antitumorale sulle cellule tumorali della prostata LNCAP umana;
6. Valutazione di esponenti di laboratorio selezionati in campioni di siero e plasma raccolti durante lo studio 24 ore, 48 ore, 72 ore e 120 ore da un episodio di danno muscolare indotto da esercizi eccentrici;

Ogni partecipante sarà allo stato idratato e prima del loro primo pasto nelle ore del mattino (8: 00-9: 00). Prima di misure adeguate, ogni partecipante aveva una settimana prima di una sessione di familiarizzazione con tutte le procedure.

La procedura ischemica verrà eseguita prima dell'inizio delle procedure di esercizi di desiderio ed eccentrici e danni muscolari in conformità con la descrizione dettagliata della procedura RIPC. Il riempimento di quattro volte della flangia di galleggiamento verrà eseguito con 5 minuti al valore di 200 mm Hg con un intervallo di riposo di 5 minuti vicino all'attacco del muscolo della coscia dritta iniziale. Tutte le procedure eseguite verranno eseguite sotto il controllo USG Doppler per eseguire una limitazione completa del flusso sanguigno arterioso.

4.4 Misurazione della potenza anaerobica degli arti inferiori (test anaerobico di wingate) per la potenza anaerobica degli arti inferiori di misurazione del test anaerobico (desiderio) verrà condotta su un ergometro a ciclo (Monark 894E, bici di picco da Sveden). Per ciascun partecipante, l'altezza della sella verrà regolata individualmente in modo che l'angolo dopo l'angolo di tratto verso il basso sia di circa 170-175 °. Prima di qualsiasi test sperimentale, ogni individuo eseguirà un riscaldamento di 5 minuti sul ciclo ergometro con tempo di 60 giri/min e 1W/kg. Dopo cinque minuti di interruzione, a ciascun partecipante verrà chiesto di pedalare con il massimo sforzo per un periodo di 30 s contro un carico resistivo fisso di 75 g/kg di massa corporea totale. A ciascun partecipante è stato chiesto di andare in bicicletta il più velocemente possibile e gli è stato dato un conto alla rovescia 3S prima che la resistenza fissa fosse applicata incoraggiamento verbale a tutti i partecipanti per mantenere la massima cadenza possibile in tutto il desiderio. I dati dell'ergometro ciclo verranno registrati tramite computer con il software MCE 5.1.

Le variabili verranno analizzate come valori assoluti (W) e relativi alla massa corporea (W/kg).

4.5 CAMPIONI DI Sangue Raccolta e misurazioni

La metodologia della raccolta del sangue per i test diagnostici sarà strettamente dipendente dai requisiti di una particolare designazione e rispetta le procedure di ricerca (stabilita sulla base dei dati della letteratura). Per l'analisi di laboratorio, verrà raccolto il sangue periferico. In conformità con il piano:

• Per desiderio: per una volta e 10 giorni RIPC-prima dell'esercizio fisico (al mattino presto, senza pasto), immediatamente dopo il completamento del test wingate (fino a 5 minuti dopo il test), dopo 30 minuti di riposo dopo il completamento del test Wingate (30-35 minuti dopo il test), 60 minuti dopo, 6 ore dopo, 24 ore dopo desidera

L'assunzione verrà eseguita in tubi standardizzati appropriati da personale medico qualificato:

Il siero e il plasma saranno separati dai campioni. La valutazione generale dello stato di omoostasi si baserà su test preliminari di laboratorio. Per la rilevazione qualitativa di singole proteine coinvolte nella tecnica di blotting occidentale di difesa antiossidante.

Per l'analisi del cfDNA: il sangue verrà raccolto in tubi di DNA senza cellule prima dell'esercizio fisico (al mattino, a stomaco vuoto), immediatamente dopo la fine della prova, 5 minuti e 60 minuti dopo la fine dell'esercizio. Il materiale raccolto verrà immagazzinato in frigorifero o su ghiaccio per l'isolamento di CFDNA.

Il cfDNA verrà raccolto in tubi di DNA senza cellule e isolato utilizzando siero e plasma Quick-CFDNA in base al protocollo del produttore. Il materiale ottenuto verrà aliquotato, immagazzinato in -200c e successivamente utilizzato per ulteriori analisi.

Tutte le procedure immunoenzimatiche proposte saranno eseguite utilizzando metodi disponibili e standardizzati. La maggior parte sarà designata con il metodo immunoeenzima (ELISA) o l'unità multiplexing di sistemi Luminex. Il test ELISA viene utilizzato per rilevare proteine specifiche nel materiale di prova usando anticorpi con coniugazione mono o policlonale. Verranno utilizzati kit ELISA reagente reagenti pronti. La concentrazione del prodotto finale sarà valutata misurando l'assorbimento e confrontando la soluzione standard. Le letture saranno fatte sul sistema ELISA Thermo Scientific Microplate e Magpix XPonent 4.2 System, Ruo.

La concentrazione di metaboliti di vitamina D verrà eseguita utilizzando cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem (QTRAP®4500 (SCIEX) SH accoppiato con il sistema HPLC EXIONLC). I campioni di siero verranno analizzati in modalità ionica positiva, usando la ionizzazione elettrospray. I dati grezzi saranno raccolti utilizzando Labsolutions LCGC. Per elaborare e quantificare i dati raccolti, verrà anche utilizzato Labsolutions LCGC. Il seguente vit. Saranno determinati i metaboliti D: 25 (OH) D3, 24,25 (OH) 2D3, 3-EPI-25 (OH) D3 e 25 (OH) D2; e i rapporti da 25 (OH) D3 a 24,25 (OH) 2D3 e 25 (OH) D3 a 3-EPI-25 (OH) D3.

Al fine di determinare la concentrazione di SAPPα, sarà necessario rimuovere completamente l'albumina dal plasma umano. I test preliminari iniziali hanno rivelato che la linearità e la sensibilità di questo ELISA non sono ottimali a causa del legame non specifico attribuito all'alto contenuto proteico del plasma umano non modificato. Pertanto, tutti i campioni di plasma devono essere immunosubtrati HSA prima dell'analisi. I livelli di ELISA di SAPPα devono essere quindi normalizzati ai segnali Western SAPP totali (unità relative). La procedura prevede la pre-frazione sierica esaurendo l'albumina sierica umana usando l'albumina igy di proteomelab umano basato su una colonna di spinel HSA (Phenomenex, Torrance, CA). La procedura sarà confermata dall'applicazione preliminare del metodo Western blot per determinare il contenuto proteico nei campioni sottoposti a purificazione. I livelli di SAPPα saranno determinati usando il metodo ELISA - Laboratori immunobiologici, gomma, Giappone.

Per la rilevazione qualitativa proteica verrà eseguita la tecnica di blotting occidentale. Il campione subirà denaturazione proteica, seguita da elettroforesi su gel. Un sintetico o anticorpo (anticorpo primario) riconosce e si lega a una specifica proteina target.

La membrana di elettroforesi viene lavata in una soluzione contenente l'anticorpo primario, prima che l'anticorpo in eccesso venga lavato. Viene aggiunto un anticorpo secondario che riconosce e si lega all'anticorpo primario. L'anticorpo secondario viene visualizzato attraverso vari metodi come colorazione, immunofluorescenza e radioattività, consentendo la rilevazione indiretta della proteina target specifica.

4.6. Linee cellulari di attività citotossica e condizioni di coltura. La linea cellulare LNCAP sarà coltivata nel mezzo RPMI 1640 (Gibco; Rockville, MD, USA) integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) (cultilab, Brasile), 100 U/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina, ed è stato incubato in un'atmosfera umidificata a 37% CO2. Verrà valutata l'attività citotossica: le cellule sono state placcate su microplati a 96 pozzetti (105 cellule/mL) in RPMI 1640 integrati con FBS al 10% in assenza o presenza di EEH (25-200 μg/mL) per 24 ore in un'atmosfera umidificata a 37 ° C e 5% di CO2. Dopo questo periodo, le cellule sono state lavate con PBS e risospese in tampone (HEPE 0,01 M, pH = 7,4, 0,14 M NaCl e 2,5 mM Cacl2). Le cellule colorate verranno etichettate e analizzate in modo fluorescente utilizzando un citometro a flusso Accuri C6 e un software specifico.

4.7 Analisi statistica I risultati verranno analizzati statisticamente utilizzando il software Statistica. Il significato statistico sarà determinato per p <0,05. Il progetto analizza la significatività delle differenze nei risultati, desideri e parametri di laboratorio tra i gruppi; Significato dei cambiamenti dopo l'analisi del desiderio e della regressione dei risultati dei test.

A seconda della distribuzione normale (test Shapiro-Wilk) delle variabili e soddisfare i criteri di omogeneità delle varianze (test di Levene) verrà eseguito il test parametrico o non parametrico. Per valutare il test statistico per i cambi di piega dei marcatori biochimici, verrà trasformato in log2.