Op proteoom gebaseerde gepersonaliseerde immunotherapie van glioblastoom

De proef omvat 60 gevallen van inoperabel recidiverend multiform glioblastoom (GBM) na twee lijnen standaardchemotherapie en volledige radiotherapie.

De eerstelijnstherapie van GBM omvat allogene haplo-identieke hematopoietische stamcellen (HSC's), dendritisch vaccin (DV) en cytotoxische lymfocyten (CTL's).

HSC's worden gebruikt om een ​​geïndividualiseerde adoptieve immuunrespons te stimuleren, om tumorcellen (TC's) toxisch te beïnvloeden en om gerichte tumorstamcellen (TSC's) te reguleren om hun reproductieve en proliferatieve potentieel te onderdrukken. Om HSC te verkrijgen, krijgt de donor gedurende 4 dagen 8 subcutane toedieningen van granulocytkoloniestimulerende factor (G-CSF) met een tussenpoos van 8-10 uur. De eerste drie dagen is een enkele dosis 2,5 mcg per 1 kg gewicht, de laatste dag wordt de dosis verdubbeld. De stamcellen worden op dag 5 geoogst. Rode bloedcellen worden door centrifugeren verwijderd. De inhoud van celmarkers wordt geëvalueerd door middel van flowcytometrie. Het resultaat wordt beoordeeld na verrijking met cytoconcentraat en verwijdering van volgroeide cellen en plasma daaruit. Het preparaat wordt bewaard in tubes van 4 ml met cryoprotector en 10% polyglucine-oplossing. Het aandeel stamcellen is niet minder dan 0,5 x 106 CD34+ en het aandeel lymfocyten is niet minder dan 0,5 x 109 per toediening.

Het monster van de hersentumor wordt verkregen door middel van stereotactische/endoscopische/open biopsie van alle patiënten die aan het onderzoek deelnemen. De TC's en TSC's zijn immunochemisch geïsoleerd uit GBM-biopsiemonster. Een deel van het tumormonster wordt gebruikt voor standaard histologische, cytologische en immunochemische testen, terwijl tumorcellen (TC's) en tumorstamcellen (TSC's) (CD133+) worden geïsoleerd van het andere deel.

Dendritische cellen worden geïsoleerd uit perifere mononucleaire bloedcellen en gekweekt. Tumormonster levert tumorspecifieke antigenen om DV te bereiden.

Bereiding van CTL's heeft tot doel het cytotoxische effect op de tumor te versterken vanwege het grote aantal circulerende CTL's. CTL's worden geïsoleerd uit ongeveer 100 ml perifeer bloed na 3 DV-toedieningen, en daarvan worden dendritische cellen (DC's) gekweekt. Vervolgens wordt herhaaldelijk perifeer bloed afgenomen en worden lymfocyten geïsoleerd. De CTL's worden verschillende keren samen gekweekt met DC's geladen met tumorantigenen (eerstelijnstherapie) of recombinante eiwitten die identiek zijn aan belangrijke oncospecifieke eiwitten (tweedelijnstherapie) om hun aantal uit te breiden (108-109). Hun immunofenotype wordt gedetecteerd en CTL's worden ingevroren. De eerste stimulatie van CTL's met DC's duurt 6-8 dagen, de tweede 2-4 dagen, de volgende 2 dagen worden de lymfocyten voor de derde en vierde keer gestimuleerd. En dan worden de ontvangen lymfocyten gedurende 2 dagen gestimuleerd door IL-2.

Zes maanden na voltooiing van de eerstelijnstherapie wordt de efficiëntie geëvalueerd en zet het cohort dat efficiëntie aantoont de therapie voort, terwijl het cohort dat geen efficiëntie aantoont, de proef voortzet met de tweedelijnstherapie.

De tweedelijns therapiearm (actieve comparatorarm) gebruikt DV met recombinante eiwitten die identiek zijn aan belangrijke oncospecifieke eiwitten, autologe CTL's en autologe HSC's met gemodificeerd proteoom.

Autologe HSC's worden ontvangen van de proefdeelnemer zoals eerder beschreven. Celpreparatie van HSC voor de actieve vergelijkingsarm wordt verkregen uit het cytoconcentraat van autologe mononucleaire cellen van perifeer bloed na mobilisatie zoals gespecificeerd voor de experimentele arm. Tumorspecifieke antigenen voor actieve comparatorgroep worden geleverd door tumorweefsel van de patiënt.

TC's en TSC's evenals HSC's van de patiënt ondergaan volledige transcriptoommapping en genexpressieprofilering (CTMGEP) en proteoommapping en eiwitprofilering (PMPP). Sleutel (3 of 4 eiwitten met maximale genormaliseerde intensiteit) oncospecifieke eiwitten (OSP) worden bepaald volgens proteoomtesten van TC's, terwijl proteoomprofilering van TSC's en het gebruik van databases van eiwit-eiwitrelaties detectie van intracellulaire signaaltransductieroutes (ISTP) onaangetast mogelijk maken door carcinogenese en in staat tot regulering. Ook worden receptormembraandoelen gedetecteerd die deze signaalroutes beïnvloeden (acceptormembraaneiwitten), evenals eiwitten die ze kunnen activeren (eiwitliganden). CTMGEP van TSC's bevestigt gediagnosticeerde functionele ISTP. Wiskundige modellering van CTMGEP en vergelijking met Affymetrix GeneChip Humane genoom U133A Array-gegevens onthullen perturbagenen die HSC's chemisch kunnen induceren en hun proteoomprofiel kunnen wijzigen om secretie van vereiste eiwitliganden te verschaffen. De database-analyse maakt het mogelijk om te begrijpen hoe veranderingen in genexpressie geïnduceerd door een laagmoleculair middel of micro-RNA overeenkomen met de waargenomen veranderingen in het onderzochte profiel. Als correspondentie significant is, wordt aangenomen dat de agent of soortgelijke agenten het effect kunnen initiëren. Als anticorrelatie significant is, wordt verondersteld dat het middel een tegengesteld effect veroorzaakt bij modificatie van genexpressie. Het transcriptoom van HSC's wordt gemodificeerd door mononucleaire cellen samen met perturbagens te kweken. Hun biologische efficiëntie wordt in vitro geëvalueerd in de Homunculus-bioreactor. Vervolgens wordt de bereiding opgeslagen zoals eerder beschreven.

Individuele DV wordt bereid uit het leukoconcentraat van perifeer bloed van de patiënt. De lymfocyten worden geïsoleerd, gekweekt met G-CSF en interleukine-2, geconditioneerd door tumorspecifieke antigenen, TNF-a en PGE2 gedurende 48 uur en beladen met recombinante eiwitten die identiek zijn aan de belangrijkste tumorspecifieke antigenen die zijn gedetecteerd bij proteoomtesten van TC's. Het basismechanisme van het individuele DV-immuuneffect is de ontwikkeling van tumortoxische lymfocyten door het organisme van de patiënt.

CTL's worden verkregen zoals eerder beschreven. De interventie wordt beschreven in de betreffende sectie.

Toxiciteit zal worden beoordeeld volgens de CTC-NCI-criteria. Efficiëntie wordt beoordeeld aan de hand van de volgende criteria:

1. Volledig effect - volledige verdwijning van alle tumorhaarden
2. Gedeeltelijk effect - -reductie van tumorgrootte en/of gemetastaseerde foci met niet minder dan 50% en geen tekenen van nieuwe neoplasmata
3. Stabilisatie - vermindering van de grootte van de tumorhaarden met minder dan 50% en geen tekenen van nieuwe neoplasmata
4. Vooruitgang - groei van tumorhaarden tijdens de therapie. In het geval van een mozaïekeffect, wanneer een deel van de foci vordert en een ander deel stabiel is of afneemt, wordt de therapie voortgezet maar worden de gevallen geanalyseerd buiten de context "Reactie op de therapie"