Inmunoterapia personalizada basada en proteoma del glioblastoma

El ensayo incluirá 60 casos de glioblastoma multiforme (GBM) recurrente no resecable después de dos líneas de quimioterapia estándar y un curso completo de radioterapia.

La terapia de primera línea de GBM involucra células madre hematopoyéticas (HSC) haploidénticas alogénicas, vacuna dendrítica (DV) y linfocitos citotóxicos (CTL).

Las HSC se utilizan para estimular la respuesta inmunitaria adoptiva individualizada, para afectar tóxicamente a las células tumorales (TC) y para regular las células madre tumorales (TSC) dirigidas a suprimir su potencial reproductivo y proliferativo. Para obtener HSC el donante recibe 8 administraciones subcutáneas de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) con intervalo de 8-10 horas durante 4 días. Los tres primeros días una dosis única es de 2,5 mcg por 1 kg de peso, el último día se duplica la dosis. Las células madre se recogen el día 5. Los glóbulos rojos se extraen mediante centrifugación. El contenido de marcadores celulares se evalúa por citometría de flujo. El resultado se evalúa tras el enriquecimiento del citoconcentrado y la eliminación de células maduras y plasma del mismo. La preparación se conserva en tubos de 4 ml con crioprotector y solución de poliglucina al 10%. La proporción de células madre no es inferior a 0,5x106 CD34+ y la proporción de linfocitos no es inferior a 0,5x109 por administración.

La muestra de tumor cerebral se obtiene mediante biopsia estereotáxica/endoscópica/abierta de todos los pacientes incluidos en el ensayo. Los TC y TSC se aíslan inmunoquímicamente de la muestra de biopsia de GBM. Una parte de la muestra tumoral se utiliza para pruebas histológicas, citológicas e inmunoquímicas estándar, mientras que las células tumorales (TC) y las células madre tumorales (TSC) (CD133+) se aíslan de la otra parte.

Las células dendríticas se aíslan de células mononucleares de sangre periférica y se cultivan. La muestra de tumor proporciona antígenos específicos de tumor para preparar DV.

La preparación de CTL tiene como objetivo potenciar el efecto citotóxico sobre el tumor debido al gran número de CTL circulantes. Los CTL se aíslan de aproximadamente 100 ml de sangre periférica después de 3 administraciones de DV, y de ellos se cultivan células dendríticas (DC). Luego, se toma repetidamente sangre periférica y se aíslan los linfocitos. Los CTL se cocultivan con DC cargadas con antígenos tumorales (terapia de primera línea) o proteínas recombinantes idénticas a proteínas oncoespecíficas clave (terapia de segunda línea) varias veces para expandir su número (108-109). Se detecta su inmunofenotipo y se crioconservan los CTL. La primera estimulación de CTL con DC dura de 6 a 8 días, la segunda dura de 2 a 4 días, los 2 días siguientes se estimulan los linfocitos por tercera y cuarta vez. Y luego los linfocitos recibidos son estimulados por IL-2 durante 2 días.

Seis meses después de completar la terapia de primera línea, se evalúa la eficiencia y la cohorte que demuestra eficiencia continúa con la terapia, mientras que la cohorte que no demuestra eficiencia continuará la prueba con la terapia de segunda línea.

El brazo de terapia de segunda línea (brazo de comparación activa) usa DV con proteínas recombinantes idénticas a proteínas oncoespecíficas clave, CTL autólogos y HSC autólogos con proteoma modificado.

Las HSC autólogas se reciben del participante del ensayo como se describió anteriormente. La preparación celular de HSC para el brazo comparador activo se obtiene del citoconcentrado de células mononucleares autólogas de sangre periférica después de la movilización como se especifica para el brazo experimental. Los antígenos específicos de tumor para el grupo de comparación activo los proporciona el tejido tumoral del paciente.

Los TC y TSC, así como las HSC del paciente, se someten a un mapeo completo de transcriptomas y perfiles de expresión génica (CTMGEP) y mapeo de proteomas y perfiles de proteínas (PMPP). Las proteínas oncoespecíficas (OSP) clave (3 o 4 proteínas con máxima intensidad normalizada) se determinan de acuerdo con las pruebas de proteoma de los TC, mientras que el perfil de proteoma de los TSC y el uso de bases de datos de relaciones proteína-proteína permiten la detección de vías de transducción de señales intracelulares (ISTP) no afectadas. por carcinogénesis y capaz de regulación. Además, se detectan dianas de la membrana del receptor para afectar estas vías de señal (proteínas de la membrana del receptor), así como proteínas que pueden activarlas (ligandos de proteínas). CTMGEP de TSC confirma ISTP funcional diagnosticado. El modelado matemático de CTMGEP y la comparación con Affymetrix GeneChip Los datos del U133A del genoma humano revelan perturbágenos capaces de inducir químicamente HSC y modificar su perfil de proteoma para proporcionar la secreción de los ligandos proteicos necesarios. El análisis de la base de datos permite comprender cómo los cambios en la expresión génica inducidos por un agente de bajo peso molecular o micro ARN se corresponden con los cambios observados en el perfil examinado. Si la correspondencia es significativa, se supone que el agente o agentes similares pueden iniciar el efecto. Si la anticorrelación es significativa, se supone que el agente inicia un efecto opuesto en la modificación de la expresión génica. El transcriptoma de las HSC se modifica cocultivando células mononucleares con perturbágenos. Su eficiencia biológica se evalúa in vitro en biorreactor Homunculus. Luego la preparación se almacena como se describió anteriormente.

El DV individual se prepara a partir del leucoconcentrado de sangre periférica del paciente. Los linfocitos se aíslan, se cultivan con G-CSF e interleucina-2, se acondicionan con antígenos específicos de tumores, TNF-α y PGE2 durante 48 horas y se cargan con proteínas recombinantes idénticas a los antígenos específicos de tumores clave detectados en las pruebas proteómicas de TC. El mecanismo básico del efecto inmunológico individual de DV es la elaboración de linfocitos tóxicos para tumores por parte del organismo del paciente.

Los CTL se obtienen como se describió anteriormente. La intervención se describe en la sección correspondiente.

La toxicidad se evaluará según los criterios del CTC-NCI. La eficiencia se evalúa de acuerdo con los siguientes criterios:

1. Efecto completo - -desaparición total de todos los focos tumorales
2. Efecto parcial - -reducción del tamaño del tumor y/o focos metastásicos en no menos del 50% y ausencia de signos de nuevas neoplasias
3. Estabilización: reducción del tamaño de los focos tumorales en menos del 50% y sin signos de nuevas neoplasias
4. Progreso: crecimiento de focos tumorales durante la terapia. En caso de efecto mosaico, cuando parte de los focos progresa y parte es estable o se reduce, se continúa con la terapia pero se analizan los casos fuera del contexto "Respuesta a la terapia"