Immunoterapia personalizzata basata sul proteoma del glioblastoma

Lo studio includerà 60 casi di glioblastoma multiforme (GBM) ricorrente non resecabile dopo due linee di chemioterapia standard e un ciclo completo di radioterapia.

La terapia di prima linea del GBM coinvolge cellule staminali ematopoietiche aploidentiche allogeniche (HSC), vaccino dendritico (DV) e linfociti citotossici (CTL).

Le HSC sono utilizzate per stimolare la risposta immunitaria adottiva individualizzata, per influenzare le cellule tumorali (TC) in modo tossico e per regolare le cellule staminali tumorali (TSC) mirate al fine di sopprimere il loro potenziale riproduttivo e proliferativo. Per ottenere HSC il donatore riceve 8 somministrazioni sottocutanee di fattore stimolante le colonie di granulociti (G-CSF) con un intervallo di 8-10 ore per 4 giorni. I primi tre giorni una singola dose è di 2,5 mcg per 1 kg di peso, l'ultimo giorno la dose è raddoppiata. Le cellule staminali vengono raccolte il giorno 5. I globuli rossi vengono prelevati mediante centrifugazione. Il contenuto dei marcatori cellulari viene valutato mediante citometria a flusso. Il risultato viene valutato dopo l'arricchimento del citoconcentrato e la rimozione delle cellule mature e del plasma da esso. La preparazione viene conservata in provette da 4 ml con crioprotettore e soluzione di poliglucina al 10%. La proporzione di cellule staminali non è inferiore a 0,5x106 CD34+ e la proporzione di linfociti non è inferiore a 0,5x109 per singola somministrazione.

Il campione di tumore al cervello viene ottenuto mediante biopsia stereotassica/endoscopica/a cielo aperto da tutti i pazienti inclusi nello studio. I TC e i TSC sono immunochimicamente isolati dal campione di biopsia GBM. Una parte del campione tumorale viene utilizzata per i test istologici, citologici e immunochimici standard, mentre le cellule tumorali (TC) e le cellule staminali tumorali (TSC) (CD133+) vengono isolate dall'altra parte.

Le cellule dendritiche sono isolate dalle cellule mononucleari del sangue periferico e coltivate. Il campione di tumore fornisce antigeni specifici del tumore per preparare DV.

La preparazione dei CTL mira a migliorare l'effetto citotossico sul tumore a causa del gran numero di CTL circolanti. I CTL vengono isolati da circa 100 ml di sangue periferico dopo 3 somministrazioni di DV e di essi vengono coltivate cellule dendritiche (DC). Quindi, il sangue periferico viene ripetutamente prelevato e i linfociti vengono isolati. I CTL sono co-coltivati ​​con DC caricate con antigeni tumorali (terapia di prima linea) o proteine ​​ricombinanti identiche a proteine ​​oncospecifiche chiave (terapia di seconda linea) per diverse volte per espandere il loro numero (108-109). Il loro immunofenotipo viene rilevato e i CTL vengono criopreservati. La prima stimolazione dei CTL con DC dura 6-8 giorni, la seconda dura 2-4 giorni, i successivi 2 giorni i linfociti vengono stimolati per la terza e quarta volta. E poi i linfociti ricevuti vengono stimolati da IL-2 per 2 giorni.

Sei mesi dopo il completamento della terapia di prima linea, viene valutata l'efficienza e la coorte che dimostra efficienza continua la terapia, mentre la coorte che non dimostra efficienza continuerà la sperimentazione con la terapia di seconda linea.

Il braccio di terapia di seconda linea (braccio di confronto attivo) utilizza DV con proteine ​​ricombinanti identiche a proteine ​​oncospecifiche chiave, CTL autologhe e HSC autologhe con proteoma modificato.

Le HSC autologhe vengono ricevute dal partecipante allo studio come descritto in precedenza. La preparazione cellulare di HSC per il braccio di confronto attivo è ottenuta dal citoconcentrato di cellule mononucleate autologhe di sangue periferico dopo la mobilizzazione come specificato per il braccio sperimentale. Gli antigeni tumorali specifici per il gruppo comparatore attivo sono forniti dal tessuto tumorale del paziente.

TC e TSC così come HSC del paziente vengono sottoposti a mappatura completa del trascrittoma e profilatura dell'espressione genica (CTMGEP) e mappatura del proteoma e profilazione proteica (PMPP). Le proteine ​​​​oncospecifiche (OSP) chiave (3 o 4 proteine ​​​​con intensità normalizzata massima) sono determinate in base al test del proteoma dei TC, mentre il profilo del proteoma dei TSC e l'uso di database di relazioni proteina-proteina consentono il rilevamento delle vie di trasduzione del segnale intracellulare (ISTP) inalterato cancerogene e capaci di regolazione. Inoltre, vengono rilevati i bersagli della membrana del recettore per influenzare queste vie di segnale (proteine ​​della membrana dell'accettore), così come le proteine ​​che sono in grado di attivarle (ligandi proteici). Il CTMGEP delle TSC conferma l'ISTP funzionale diagnosticato. Modellazione matematica di CTMGEP e confronto con Affymetrix GeneChip Human genoma U133A I dati dell'array rivelano perturbageni in grado di indurre chimicamente HSC e di modificare il loro profilo proteomico al fine di fornire la secrezione dei ligandi proteici richiesti. L'analisi del database permette di comprendere come i cambiamenti nell'espressione genica indotti da un agente a basso peso molecolare o micro RNA corrispondano ai cambiamenti osservati nel profilo esaminato. Se la corrispondenza è significativa, si suppone che l'agente o agenti simili possano iniziare l'effetto. Se l'anticorrelazione è significativa, si suppone che l'agente inizi un effetto opposto nella modificazione dell'espressione genica. Il trascrittoma delle HSC viene modificato co-coltivando cellule mononucleate con perturbageni. La loro efficienza biologica è valutata in vitro nel bioreattore Homunculus. Quindi la preparazione viene memorizzata come descritto in precedenza.

Il DV individuale viene preparato dal leucoconcentrato di sangue periferico del paziente. I linfociti sono isolati, coltivati ​​con G-CSF e interleuchina-2, condizionati da antigeni tumore-specifici, TNF-α e PGE2 per 48 ore e caricati con proteine ​​ricombinanti identiche agli antigeni tumore-specifici chiave rilevati ai test proteomici dei TC. Il meccanismo di base dell'effetto immunitario del DV individuale è l'elaborazione di linfociti tossici tumorali da parte dell'organismo del paziente.

I CTL si ottengono come descritto in precedenza. L'intervento è descritto nell'apposita sezione.

La tossicità sarà valutata secondo i criteri CTC-NCI. L'efficienza è valutata secondo i seguenti criteri:

1. Effetto completo - -completa scomparsa di tutti i focolai tumorali
2. Effetto parziale - -riduzione delle dimensioni del tumore e/o dei focolai metastatici di non meno del 50% e assenza di segni di nuove neoplasie
3. Stabilizzazione: riduzione delle dimensioni dei focolai tumorali di meno del 50% e nessun segno di nuove neoplasie
4. Progresso: crescita dei focolai tumorali durante la terapia. In caso di effetto mosaico, quando una parte dei focolai progredisce e una parte è stabile o in diminuzione, la terapia viene proseguita ma i casi vengono analizzati fuori contesto "Risposta alla terapia"