Otwarty szlak γIFN dla ataksji Friedreicha

Ataksja Friedreicha (FRDA) to wyniszczająca choroba neurodegeneracyjna, która dotyka dzieci i młodych dorosłych. Pacjenci stają się stopniowo niezdolni do koordynowania ruchów i chodzenia, aż do wystąpienia poważnej niepełnosprawności. U większości pacjentów rozwija się kardiomiopatia rozstrzeniowa i zastoinowa niewydolność serca. Choroba ma charakter nieremisyjny i znacznie skraca oczekiwaną długość życia. FRDA jest chorobą genetyczną dziedziczoną w sposób autosomalny recesywny. Pacjenci z FRDA wykazują nieprawidłowe ekspansje trypletów GAA w pierwszym intronie genu frataksyny, które uniemożliwiają prawidłową ekspresję genu. Poziomy frataksyny, białka mitochondrialnego biorącego udział w metabolizmie żelaza i produkcji energii, są niewystarczające, a komórki ulegają długotrwałemu stresowi i przedwczesnej śmierci. Najbardziej dotknięte niedoborem frataksyny są neurony obwodowe zwojów korzeni grzbietowych (DRG) i neurony jądra zębatego móżdżku.

FRDA dotyka 1 na 50 000 osób w krajach zachodnich i nie ma zatwierdzonej terapii. Niedawno wykazano, że interferon gamma (γIFN), naturalny regulator odpowiedzi immunologicznej i metabolizmu żelaza, stymuluje transkrypcję genu frataksyny i promuje akumulację frataksyny w komórkach, w tym komórkach z defektem frataksyny pochodzących od pacjentów z FRDA. Ponadto przedłużone leczenie myszy YG8R, zwierzęcego modelu FRDA, za pomocą γIFN powoduje akumulację frataksyny w neuronach DRG i znacząco zapobiega pogorszeniu wydajności czuciowo-ruchowej myszy w czasie.

Ponieważ γIFN jest również lekiem dostępnym na rynku jako białko rekombinowane (γIFN - 1b, TD Imukin® i Actimmune®) i został już dopuszczony do dwóch wskazań pediatrycznych (osteopetroza złośliwa i przewlekła choroba ziarniniakowa), może stanowić szybko dostępny lek terapeutyczny opcja dla pacjentów z FRDA.

Główną przeszkodą w skutecznym ustaleniu skuteczności leczenia w FRDA jest brak wiarygodnych i czułych biomarkerów. Wskaźniki kliniczne (skale specyficzne dla choroby, czasowe testy wydajności) są podatne na zmienność między oceniającymi, a przede wszystkim, chociaż są ważne i wrażliwe na zmiany długoterminowe, są bardzo nieskuteczne w wychwytywaniu zmian w krótkim przedziale czasu (miesiące), zwykle używanym w randomizowane badania kliniczne (RCT).

Zaawansowane techniki neuroobrazowania, takie jak morfometria oparta na wokselach (VBM), obrazowanie ważone podatnością (SWI), obrazowanie tensora dyfuzji (DTI) i funkcjonalne obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (fMRI) mogą dostarczyć obiektywnych wskaźników postępu choroby, które mogłyby służyć jako parakliniczny punkt końcowy w próbach terapeutycznych. Zastępcze punkty końcowe oparte na wskaźnikach neuroobrazowania były szeroko stosowane w innych chorobach neurologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane, a ich wprowadzenie znacznie przyspieszyło rozpoznanie skutecznych terapii i ich długoterminową ocenę.

W ostatnich latach badania MRI in vivo dostarczyły informacji dotyczących uszkodzeń obszarów móżdżku, mózgu i rdzenia kręgowego zaangażowanych w FRDA i inne genetycznie uwarunkowane ataksje, które mogą być przydatne do monitorowania postępu choroby.

Wraz z pojawieniem się VBM możliwe jest ilościowe określenie stopnia atrofii, monitorowanie jej w czasie i identyfikacja różnych wzorców typowych dla określonej postaci ataksji. W różnych badaniach wykazano istotną korelację między stopniem zaniku móżdżku, ciężkością obrazu klinicznego, a także czasem trwania choroby.

Badanie pilotażowe przeprowadzone w kohorcie 9 nastolatków dotkniętych FRDA, którzy przeszli 6-miesięczną terapię deferypronem, wykazało znaczące zmniejszenie średniego sygnału R2* w jądrach zębatych móżdżku, będącego wskaźnikiem magazynowania żelaza w tkankach. Modyfikacje wzorca fMRI w odpowiedzi na określone zadania obejmujące zarówno motorykę, jak i zdolność planowania wykazano również u pacjentów z FRDA, a protokoły oparte na fMRI mogą stanowić dodatkowy wskaźnik postępu choroby lub modyfikacji wywołanej terapią.

Cele i cel proponowanego badania:

• Badanie bezpieczeństwa leczenia γIFN podawanego przez 6 miesięcy w końcowej dawce 200 mcg trzy razy w tygodniu u pacjentów z FRDA.
• Zbadaj wpływ leczenia γIFN na specyficzną dla choroby skalę kliniczną (SARA)
• Przetestuj wpływ takiego leczenia na zestaw wtórnych obrazowań, laboratoryjnych i klinicznych punktów końcowych:

• Zmiany fMRI u pacjentów FRDA wykonujących protokół stukania palcem

  • parametry DTI
  • Grubość ściany komory mierzona za pomocą Ekokardiogramu (EcoCG)
  • Grubość RNFL mierzona metodą OCT
  • Poziomy frataksyny w lizatach komórkowych przygotowanych z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC)
  • Miara wpływu zmian na jakość życia i niepełnosprawności. Na jakiej wcześniejszej pracy opiera się ten projekt? Dowody na możliwą skuteczność rekombinowanego γIFN w FRDA zostały zebrane zarówno w modelu zwierzęcym choroby, jak i u pacjentów z FRDA. U pacjentów z FRDA niedawno zakończone badanie fazy II wykazało znaczną poprawę w ocenie FARS po 3 miesiącach leczenia schematem 100 mcg, 3 razy w tygodniu. Co więcej, inne niedawno zakończone badanie fazy II sugeruje, że dawka 200 mcg jest dość dobrze tolerowana przez pacjentów z FRDA.

Przegubowy protokół MRI dla pacjentów FRDA w wieku 12-50 lat, który obejmował DTI, VBM i fMRI zgodnie z selektywnym paradygmatem motorycznym, został przetestowany, zatwierdzony i wdrożony w Instytucie badaczy. Za pomocą tego protokołu badacze ocenili 22 pacjentów z FRDA i 15 zdrowych osób z grupy kontrolnej dobranych pod względem wieku i płci i stwierdzili znaczące różnice w parametrach DTI (FA i MD) w istocie białej móżdżku, długich drogach czuciowych i ruchowych, głównych drogach spoidłowych oraz w sygnale BOLD intensywność i rozkład sygnału BOLD podczas wykonywania testu stukania palcem. Te ostatnie zmiany specyficzne dla choroby były najbardziej widoczne w korze móżdżku po tej samej stronie. Zaobserwowane zmiany korelowały ze stopniem upośledzenia neurologicznego i funkcjonalnego mierzonego zwalidowanymi skalami.

Te wstępne wyniki wskazują, że zmiany DTI i fMRI mogą funkcjonować jako skuteczne zastępcze punkty końcowe w RCT dla pacjentów z FRDA.

Zaprojektuj badanie pilotażowe z otwartą etykietą. Pierwszorzędowy punkt końcowy bezpieczeństwa: Bezpieczeństwo stosowania γIFN przez 6 miesięcy w dawkach 200 mcg 3 razy w tygodniu Pierwszorzędowy punkt końcowy skuteczności: Zmiany wyniku SARA w okresie leczenia w porównaniu z zarejestrowanymi w okresie przed leczeniem i w obserwacji po leczeniu Kropka

Drugorzędowe punkty końcowe:

o zmiany w: sygnale BOLD uzyskanym podczas selektywnego zadania ruchowego (stukanie palcem)

• Parametry DTI (FA, MD) w istocie białej móżdżku, drogach długich i spoidłowych

• Grubość ściany komory (Eco CG)

  • Grubość RNFL (OCT)

• Zawartość frataksyny w PBMC
• Zmiany w pomiarze QoL (SF-36)
• Zmiany wskaźnika niepełnosprawności (WHO-DAS 2.0)

Przedmioty

Kryteria przyjęcia:

• molekularnie zdefiniowany FRDA,
• chęć udziału w badaniu i podpisanie formularza świadomej zgody.

Aby kontrolować trwające pogorszenie związane z chorobą, badacze będą rekrutować tylko tych pacjentów, którzy byli już badani za pomocą protokołu MRI i skal funkcjonalnych wskazanych poniżej 12 miesięcy przed rozpoczęciem niniejszego badania.

Kryteria wyłączenia:

• obecność jakichkolwiek przeciwwskazań do badania MRI,
• obecność klinicznie istotnej choroby serca, wątroby lub nerek lub innych niestabilnych medycznie stanów.
• Znana wrażliwość na γIFN.
• Wcześniejsza ekspozycja na rekombinowaną hematopoetynę.
• Ciągłe stosowanie desferipronu lub innego specyficznego leczenia FRDA
• ciąża lub laktacja

Badany lek γIFN (Imukin 100 mcg/fiolkę)

Leczenie będzie:

1. pierwsze dwa tygodnie: 100 mcg/trzy razy w tygodniu Od 3 tygodnia: 200 mcg trzy razy w tygodniu przez kolejne 22 tygodnie

   Protokół obrazowania

   Badanie MRI zostanie przeprowadzone w 4 punktach T:

   - T-12 do -6: w tym punkcie zostaną wykorzystane dane już przechowywane w ciągu ostatniego roku z opublikowanego badania MRI badaczy na 18 osobach

   - T0: w momencie rekrutacji

   - T6: po 6 miesiącach leczenia

   - T+6: 6 miesięcy po zakończeniu leczenia Protokół zostanie pozyskany na skanerze 3 T wyposażonym w 32-kanałową cewkę do badania głowy i będzie zawierał sekwencje morfologiczne, strukturalne (DTI) i czynnościowe (fMRI).

   Sekwencja TFE 3D ważona T1 (TR/TE=8,2/3,7, rozmiar woksela = 1x1x1 mm, 150 warstw) zostanie pozyskany w celu uzyskania danych morfologicznych odpowiednich do analizy wolumetrycznej dla morfometrii opartej na wokselach.

   Dane DTI zostaną pozyskane za pomocą sekwencji EPI ważonej T2 (rozmiar woksela = 2,5 x 2,5 x 2,5 mm) wzdłuż 32 niewspółliniowych kierunków, z wieloma wartościami b (0, 300, 1100 s/mm2) i będą oceniane off-line za pomocą dedykowanego oprogramowania Tortoise. Dane funkcjonalne zostaną pozyskane za pomocą sekwencji EPI ważonej T2 (TR/TE=2000/20, grubość=2,5mm, 40 plastrów) pokrywających cały mózg i móżdżek.

   Obrazy czynnościowe zostaną uzyskane podczas zadania wymagającego manualnej koordynacji i precyzji, w celu zbadania możliwego wpływu leczenia na funkcjonalną organizację sieci motorycznych.

   Protokół laboratoryjny Badanie Eco CG zostanie przeprowadzone w T0, T6, T+6 z ustalonym protokołem. Monitorowanie stężenia frataksyny będzie wykonywane w T0, T3 (po 3 miesiącach) i T6 (po 6 miesiącach).

   Środki kliniczne i monitorowanie bezpieczeństwa Wyszkolony neurolog odwiedzi każdego pacjenta w T0, T3, T6 i T+6 i zgłosi wszystkie parametry życiowe oraz zarejestruje inne obiektywne wyniki, w tym zdarzenia niepożądane (AE).

   Szczegółowa lista kontrolna ze wszystkimi znanymi zdarzeniami niepożądanymi zgłoszonymi podczas leczenia γIFN zostanie przedstawiona każdemu uczestnikowi w T0, T3, T6.

   Następujące badanie krwi zostanie wykonane w T0, T3, T6:

   -Liczba krwinek, szybkość sedymentacji erytrocytów, Ca2+, Cl-, Na+, Mg2+, K+, albuminy, globuliny, glukoza, azot mocznikowy we krwi, kwas moczowy, kreatynina, transaminaza asparaginianowa, transaminaza alaninowa, żelazo, ferrytyna, transferyna

   Analiza statystyczna W przypadku protokołu MRI każdy zestaw danych będzie przetwarzany za pomocą dedykowanego potoku i odpowiedniego oprogramowania.

   Woluminy T1 będą przetwarzane zgodnie ze standardowym potokiem FMRIB Software Library (FSL) i przy użyciu VBM. Pierwszym krokiem będzie utworzenie specyficznego dla badania szablonu istoty szarej, przy użyciu procedury „buildtemplateparallel” narzędzia Advanced Normalization Tools (ANT), która wykona iteracyjną konstrukcję szablonu z elastycznymi transformacjami.

   Dane DTI zostaną skorygowane pod kątem prądów wirowych i artefaktów ruchu, a następnie obliczony zostanie tensor dyfuzji przy użyciu nieliniowego monowykładniczego modelu dyfuzji, uzyskując mapy „anizotropii ułamkowej” (FA), „średniej dyfuzyjności” (MD), „dyfuzyjność promieniowa” (RD) i „dyfuzyjność osiowa” (AD).

   Aby określić ilościowo różnice statystyczne w czasie, dane dotyczące dyfuzji wszystkich podmiotów zostaną przeniesione do wspólnej przestrzeni poprzez sztywne, afiniczne i dyfeomorficzne rejestracje oparte na samym tensorze dyfuzji. Korzystając z przekształceń obliczonych na tensorach, zostaną przeprowadzone 3 różne testy:

   - Statystyka przestrzenna oparta na traktatach (TBSS);

   - Wokselowa analiza statystyczna oparta na permutacjach;

   - Analiza statystyczna obszarów zainteresowania (ROI) z uogólnionymi modelami liniowymi (GLM).

   Dane fMRI będą przetwarzane przy użyciu Statistical Parametric Mapping 8 (SPM8). Analiza efektu stałego pierwszego poziomu zostanie przeprowadzona dla każdego podmiotu przy użyciu globalnego modelu liniowego i parametrów ruchu jako czynników zakłócających. W przypadku analizy na poziomie grupy zostanie przeprowadzona analiza losowych efektów z kontrastami uzyskanymi w analizie krokowej pojedynczego podmiotu. Ostatecznie zostanie obliczony test t dla dwóch próbek, aby sprawdzić różnice w aktywacjach w czasie.

   Wszystkie dane zależne od czasu (w tym wyniki neuroobrazowania pod kątem zwrotu z inwestycji) zostaną przeanalizowane przy użyciu wielowymiarowych liniowych modeli mieszanych, w tym punktów czasowych jako czynnika powtarzającego się w obrębie podmiotu i obejmującego płeć, wiek zachorowania, czas trwania choroby, lata nauki i liczbę powtórzeń GAA1 w obrębie mniejszego allelu FXN jako zmienne towarzyszące bez zainteresowania. N przypadek statystycznie istotny (p<0,05) ogólnego wpływu czasu, zostaną przeprowadzone porównania parami między punktami czasowymi i poprawione dla wielokrotnych porównań między parami punktów czasowych. Zostanie również przeprowadzona analiza korelacji między możliwymi modyfikacjami wyników SARA między kolejnymi punktami czasowymi a odpowiednimi zmianami w miarach strukturalnych i funkcjonalnych pochodzących z MRI.

   Referencje (projekt badawczy):

   - Akhlaghi H, Yu J, Corben L, Georgiou-Karistianis N, Bradshaw JL, Storey E, Delatycki MB, Egan GF. Deficyty poznawcze w ataksji Friedreicha korelują ze zmianami mikrostrukturalnymi w przewodzie zębowo-zębowym. Móżdżek. 2013 2 października .

   - Akhlaghi H, Corben L, Georgiou-Karistianis N, Bradshaw J, Delatycki MB, Storey E, Egan GF. Funkcjonalne badanie MRI dysfunkcji motorycznych w ataksji Friedreicha. Mózg Res. 30 sierpnia 2012;1471:138-54.

   - Boddaert N, Le Quan Sang KH, Rötig A, Leroy-Willig A, Gallet S, Brunelle F, Sidi D, Thalabard JC, Munnich A, Cabantchik ZI. Selektywna chelatacja żelaza w ataksji Friedreicha: implikacje biologiczne i kliniczne. Krew. 1 lipca 2007;110(1):401-8.

   - Della Nave R, Ginestroni A, Tessa C, Salvatore E, Bartolomei I, Salvi F, Dotti MT, De Michele G, Piacentini S, Mascalchi M. Zwyrodnienie dróg istoty białej mózgu w ataksji Friedreicha. Badanie MRI in vivo z wykorzystaniem statystyk przestrzennych opartych na przewodach i morfometrii opartej na wokselach.Neuroimage. 2008a 1 marca;40(1):19-25.

   - Della Nave R, Ginestroni A, Tessa C, Cosottini M, Giannelli M, Salvatore E, Sartucci F, De Michele G, Dotti MT, Piacentini S, Mascalchi M. Uszkodzenia strukturalne mózgu w ataksji rdzeniowo-móżdżkowej typu 2. Morfometria oparta na wokselach badanie. Zaburzenie ruchu. 2008b 30 kwietnia;23(6):899-903. doi: 10.1002/mds.21982.

   - Di Prospero NA, Baker A, Jeffries N, Fischbeck KH. Neurologiczne skutki idebenonu w dużych dawkach u pacjentów z ataksją Friedreicha: randomizowane badanie kontrolowane placebo. Lancet Neurol. Październik 2007;6(10):878-86.

   - Georgiou-Karistianis N, Akhlaghi H, Corben LA, Delatycki MB, Storey E, Bradshaw JL, Egan GF. Zmniejszona funkcjonalna aktywacja mózgu w ataksji Friedreicha przy użyciu zadania efektu Simona. Mózg i poznanie 79 (2012) 200-208.

   - Jayakumar PN, Desai S, Pal PK, Balivada S, Ellika S, Kalladka D. Funkcjonalne korelaty braku koordynacji u pacjentów z ataksją rdzeniowo-móżdżkową 1: wstępne badanie fMRI. J Clin Neurosci. 2008 marzec;15(3):269-77. doi: 10.1016/j.jocn.2007.06.021. Epub 2008 10 stycznia.

   - Mantovan MC, Martinuzzi A, Squarzanti F, Bolla A, Silvestri I, Liessi G, Macchi C, Ruzza G, Trevisan CP, Angelini C. Badanie stanu psychicznego w ataksji Friedreicha: połączone badanie neuropsychologiczne, behawioralne i neuroobrazowe. Eur J Neurol. 2006 sierpień;13(8):827-35.

   - Montermini L, Richter A, Morgan K, Sprawiedliwość CM, Julien D, Castellotti B, Mercier J, Poirier J, Capozzoli F, Bouchard JP, Lemieux B, Mathieu J, Vanasse M, Seni MH, Graham G, Andermann F, Andermann E, Melançon SB, Keats BJ, Di Donato S, Pandolfo M (1997) Zmienność fenotypowa w ataksji Friedreicha: rola związanej ekspansji powtórzeń trypletowych GAA. Ann Neurol 41:675-682.

   - Ormerod IE, Harding AE, Miller DH, Johnson G, MacManus D, du Boulay EP, Kendall BE, Moseley IF, McDonald WI. Rezonans magnetyczny w chorobach zwyrodnieniowych ataksji.

   - J Neurol Neurosurg Psychiatria. Styczeń 1994;57(1):51-7. Recenzja.

   - Pfefferbaum A, Adalsteinsson E, Rohlfing T, Sullivan EV. Szacunki MRI stężenia żelaza w mózgu w normalnym starzeniu: porównanie metod zależnych od pola (FDRI) i fazowych (SWI). Neuroobraz. 2009 15 sierpnia;47(2):493-500.

   - Pierpaoli C, Walker L, Irfanoglu MO, Barnett A, Basser P, Chang L-C, Koay C, Pajevic S, Rohde G, Sarlls J i Wu M. 2010, TORTOISE: zintegrowany pakiet oprogramowania do przetwarzania danych MRI dyfuzyjnego, 18. doroczne spotkanie ISMRM, Sztokholm, Szwecja, nr 1597

   - Prakash N, Hageman N, Hua X, Toga AW, Perlman SL, Salamon N. Wzory ułamkowych zmian anizotropii w istocie białej konarów móżdżku odróżniają ataksję rdzeniowo-móżdżkową-1 od zaników wieloukładowych i innych zespołów ataksji. Neuroobraz. 2009 47 sierpnia Suppl 2: T72-81. doi: 10.1016/j.neuroimage.2009.05.013. Epub 2009 14 maja.

   - Schenck JF, Zimmerman EA. Obrazowanie rezonansu magnetycznego wysokiego pola żelaza w mózgu: narodziny biomarkera? NMR Biomed. Listopad 2004;17(7):433-45. Recenzja.

   - Schmitz-Hübsch T, du Montcel ST, Baliko L, Berciano J, Boesch S, Depondt C, Giunti P, Globas C, Infante J, Kang JS, Kremer B, Mariotti C, Melegh B, Pandolfo M, Rakowicz M, Ribai P, Rola R, Schöls L, Szymanski S, van de Warrenburg BP, Dürr A, Klockgether T, Fancellu R. Skala oceny i oceny ataksji: opracowanie nowej skali klinicznej. Neurologia. 13 czerwca 2006;66(11):1717-20.

   - Schulz JB, Dehmer T, Schöls L, Mende H, Hardt C, Vorgerd M, Bürk K, Matson W, Dichgans J, Beal MF, Bogdanov MB. Stres oksydacyjny u pacjentów z ataksją Friedreicha. Neurologia. 2000 12 grudnia;55(11):1719-21.

   - Seyer L, Greeley N, Foerster D i in. Otwarte badanie interferonu gamma 1b (IFN-γ) w ataksji Friedreicha. Acta Neurologica Scandinavica 2014 21 października. doi: 10.1111/ane.12337

   - Sormani MP, Bruzzi P. uszkodzenia MRI jak surogat dla nawrotów w stwardnieniu rozsianym: metaanaliza randomizowanych prób. Lancet Neurol. Lipiec 2013;12(7):669-76. doi: 10.1016/S1474-4422(13)70103-0.

   - Stankiewicz J, Panter SS, Neema M, Arora A, Batt CE, Bakshi R. Żelazo w przewlekłych zaburzeniach mózgu: obrazowanie i implikacje neuroterapeutyczne. Neuroterapeutyki. Lipiec 2007;4(3):371-86.

   - Subramony SH, May W, Lynch D, Gomez C, Fischbeck K, Hallett M, Taylor P, Wilson R, Ashizawa T; Spółdzielnia Grupa Ataxia. Mierzenie ataksji Friedreicha: wiarygodność neurologicznej skali oceny między oceniającymi. Neurologia. 12 kwietnia 2005;64(7):1261-2.

   • Tai G, Corben LA, Gurrin L. i in. Badanie do 12 lat obserwacji ataksji Friedreicha z wykorzystaniem czterech narzędzi pomiarowych. JNNP 2014, 11 sierpnia jako 10.1136/jnnp-2014-308022
   • Tomassini, B., Arcuri, G., Fortuni, S., Sandi, C., Ezzatizadeh, V., Casali, C., Condo, I., Malisan, F., Al-Mahdawi, S., Pook, M i Testi R. (2012) Interferon gamma zwiększa poziom frataksyny i koryguje deficyty czynnościowe w modelu ataksji Friedreicha. Hum Mol Genet, 21, 2855-2861.
   • Trouillas P, Takayanagi T, Hallett M, Currier RD, Subramony SH, Wessel K, Bryer A, Diener HC, Massaquoi S, Gomez CM, Coutinho P, Ben Hamida M, Campanella G, Filla A, Schut L, Timann D, Honnorat J, Nighoghossian N, Manyam B. International Cooperative Ataxia Rating Scale do farmakologicznej oceny zespołu móżdżkowego. Komitet Neurofarmakologii Ataksji Światowej Federacji Neurologii. J Neurol Sci. 1997 12 lutego;145(2):205-11.
   • Velasco-Sánchez D, Aracil A, Montero R, Mas A, Jiménez L, O'Callaghan M, Tondo M, Capdevila A, Blanch J, Artuch R, Pineda M. Terapia skojarzona z idebenonem i deferypronem u pacjentów z ataksją Friedreicha. Móżdżek. 2011 marzec;10(1):1-8.
   • Villanueva-Haba V, Garcés-Sánchez M, Bataller L, Palau F, Vílchez J. Badanie neuroobrazowania z analizą morfometryczną ataksji dziedzicznej i idiopatycznej. Neurologia. 2001 marzec;16(3):105-11.
   • ŻÓŁWI https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/nihpd/TORTOISE